Clonagem, expressão em E. coli e purificação dos domínios citoplasmáticos da 'Ca POT. 2+'-ATPase de retículo sarcoplasmático (1999)
- Authors:
- Autor USP: HERING, VITOR RENAUX - IQ
- Unidade: IQ
- Sigla do Departamento: QBQ
- Assunto: BIOLOGIA MOLECULAR
- Language: Português
- Abstract: Dois fragmentos do CDNA da 'Ca POT. 2+'-ATPase de retículo sarcoplasmático de coelho, codificando os domínios citoplasmáticos menor e maior desta proteína, foram separadamente clonados no vetor pQE9 Permitindo sua expressão em Eschericília coli. Cada domínio foi expresso na forma de uma proteína de fusão, contendo seis resíduos de histidina na porção amino terminal. Ambas as proteínas, localizadas na fração insolúvel do lisado bacteriano, foram solubilizadas na presença de uréia 4,5 Me purificadas por cromatografia de afinidade utilizando níquel imobilizado. Otimizou-se condições para eliminação gradual da uréia por diálise, sendo testados diferentes conteúdos salinos. Observou-se que tampão contendo sulfato de amônio 200 mM eliminou completamente a formação de agregados durante o processo de renaturação, permitindo a obtenção de 12 a 15 mg de cada proteína purificada por litro de meio de cultura. Em contraste ao KCI, sulfato de amônio ou perclorato de sódio conferiram prolongada estabilidade às proteínas. Na presença dos dois últimos sais o domínio citoplasmático maior manteve a ligação de ATP com alta afinidade por pelo menos uma semana, apresentando um Kd de 200 gM. A afinidade obtida é idêntica à descrita por Moutin et al. Na presença de KCI (J. Biol. Chem. 269: 11147-11154, 1994). Determinação da estrutura secundária foi feita por espectroscopia de dicroísmo circular. O domínio citoplasmático menor apresentou 27% de hélice alfa e 19 a31% de folha beta,dependendo do algorítmo de devolução utilizado. O domínio citoplasmático maior apresentou 24% de hélice alfa e 17 a 37% de folha beta. Os conteúdos de estrutura secundária obtidos experimentalmente confirmaram em parte os valores da literatura, provenientes da análise da seqüência primária e da predição da estrutura secundária da 'Ca POT. 2+'-ATPase nativa
- Imprenta:
- Data da defesa: 18.11.1999
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ABNT
HERING, Vitor Renaux. Clonagem, expressão em E. coli e purificação dos domínios citoplasmáticos da 'Ca POT. 2+'-ATPase de retículo sarcoplasmático. 1999. Dissertação (Mestrado) – Universidade de São Paulo, São Paulo, 1999. . Acesso em: 01 jun. 2024. -
APA
Hering, V. R. (1999). Clonagem, expressão em E. coli e purificação dos domínios citoplasmáticos da 'Ca POT. 2+'-ATPase de retículo sarcoplasmático (Dissertação (Mestrado). Universidade de São Paulo, São Paulo. -
NLM
Hering VR. Clonagem, expressão em E. coli e purificação dos domínios citoplasmáticos da 'Ca POT. 2+'-ATPase de retículo sarcoplasmático. 1999 ;[citado 2024 jun. 01 ] -
Vancouver
Hering VR. Clonagem, expressão em E. coli e purificação dos domínios citoplasmáticos da 'Ca POT. 2+'-ATPase de retículo sarcoplasmático. 1999 ;[citado 2024 jun. 01 ]
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