Aspectos estruturais e funcionais da crotamina nativa e quimicamente modificada (2001)
- Authors:
- Autor USP: MANCIN, ADRIANA CRISTINA - FMRP
- Unidade: FMRP
- Sigla do Departamento: RBI
- Subjects: SERPENTES; VENENOS DE ORIGEM ANIMAL (ESTUDO;TOXICIDADE); BIOQUÍMICA
- Language: Português
- Abstract: As peçonhas de serpentes provavelmente são os mais complexos de todos os venenos. Aproximadamente 90 a 95% do seu peso seco é constituído por proteínas, compreendendo grande variedade de enzimas e toxinas não enzimáticas (França & Fan, 1992). A peçonha de Crotalus durissus terrificus possui quatro toxinas majoritárias: a convulxina (Prado-Franceschi, 1970), um componente que induz convulsões; a crotoxina (Slotta & Franenkel-Conrat, 1938-1939), uma neurotoxina de ação preferencial pré-sináptica; giroxina (Barrio, 1961), uma enzima com atividade similar à trombina; e crotamina (Gonçalves & Vieira, 1950), um polipeptídeo mionecrótico e neurotóxico. Os estudos farmacológicos e bioquímicos das peçonhas de serpentes, feitos nas últimas três ou quatro décadas, têm mostrado a riqueza de enzimas, toxinas, compostos biologicamente ativos, e a grande variedade de suas ações. Conseqüentemente, numerosas tentativas têm sido feitas para se utilizarem esses compostos como ferramentas bioqímicas ou farmacológicas e até mesmo no auxílio para diagnoses ou na terapêutica. A crotamina foi isolada por Gonçalves & Vieira em 1950, por métodos eletroforéticos. A administração de crotamina em cobaias, camundongos, coelhos e ratos mostrou que esta causava paralisia dos membros posteriores, contratura dos membros anteriores e dificuldades respiratórias. Porém esses sintomas não foram observados após administração dsta miotoxina em pombos, galináceos ou rãs (Cheymol etal., 1971 a, b). Gonçalves & Vieira (1950) e Laure et al. (1971) quantificaram a cromatina em amostras individuais de venenos, mostrando que a quantidade é extremamente variável, correspondendo de 9,6 a 53,7% do veneno total. Em 1975, Laure determinou a seqüência de seus aminoácidos e desde então, várias miotoxinas básicas homólogas têm sido descritas e seqüenciadas: miotoxina a, de Crotalus viridis viridis (Fox et al., 1979), miotoxinas I e II, de Crotalus viridis ) concolor (Engle et al., 1983), peptídeo C, de Crotalus viridis helleri (Maeda et al., 1978) e toxina CAM, de Crotalus adamateus (Mebs & Kornalik, 1984). Essas pequenas miotoxinas básicas possuem seqüências altamente conservadas, apresentando similaridade entre 83 e 98%, ponto isoelétrico maior do que 9 e massa molecular relativa aproximada de 5.000. Possuem grande quantidade de aminoácidos básicos e seis resíduos de Cys envolvidas em três pontes dissulfeto. A miotoxina a faz as pontes entre Cys4-Cys36, Cy11-Cys30 e Cys18-Cys37 (Fox et al., 1979); já a crotamina faz as pontes entre Cys4-Cys37, Cys11-Cys36 e Cys18-Cys30 (Conti, 1981).Segundo Cheymol et al. (1971 a, b), a crotamina age no canal de sódio ou em seu modulador aumentando a permeabilidade da membrana ao sódio. Estudando preparações neuromusculares in situ, verificaram que a crotamina age sobre músculos esqueléticos desnervados, indicando que ela não age sobre a junção neuromuscular. A d-tubocurarina não inibe a ação da crotamina,portanto, esta última não age nos sítios pós-sinápticos. mas a ação da crotamina pode ser antagonizada pela tetrodotoxina, pelos íons cálcio e magnésio. A tetrodotoxina é um inibidor específico de transporte de íons sódio através de membranas excitáveis. Chang & Tseng (1978) mostraram que a crotamina é causada por um aumento da permeabilidade da membrana muscular aos íons sódio. Estudos mais recentes (Fletcher et al., 1996) mostraram que a crotamina altera o fluxo de íons cálcio pela abertura do receptor de rianodina no seu canal de liberação. Em fibras musculares intactas ocorre uma abertura do canal aos íons sódio, e em cultura primária há a necessidade da internalização da crotamina para estimular a corrente desses íons. A crotamina pertence a uma família de pequenas miotoxinas básicas que possuem estruturas e ações muito semelhantes e estão presentes em outras peçonhas de cascavéis ) (Bober et al., 1988). Esta toxina vem sendo estudada como futuro modelo para o desenho de drogas analgésicas por apresentar atividade semelhante à morfina, quando ensaiada pelos testes de placa quente e de contorção induzida pelo ácido acético (Mancin et al., 1998). Os resultados revelaram que o veneno bruto e a fração isolada, crotamina, possuem atividade analgésica.Com relação à crotamina, os resultados revelaram uma ação analgésica tempo-dose dependente, semelhante à morfina, ou seja, agindo via receptores opióides, porém cerca de 50 vezes maior em base ponderal.Crotamina reduzida e carboximetilada e crotamina acetilada também apresentam atividade similar à toxina nativa, porém com essas modificações foi possível extinguir o efeito tóxico de prostação das patas posteriores. A estrutura secundária da crotamina foi estudada por espectropia Raman e mostrou segmentos em 'beta'-folha e 'alfa'-hélice (Kawano et al., 1980). Por outro lado, experimentos feitos com a miotoxina a indicaram como predominante a conformação 'beta'-folha, sem a presença significante de conformação 'alfa'-hélice (Bieber & Nedelkov, 1997).Observações sobre a estrutura terciária da crotamina foram obtidas por Beltran et al. (1990) através de estudos de espalhamento de raios-X (SAXS), que foram feitos com a crotamina na forma de monômero em solução (pH4,5). Devido à alta homologia existente entre estas duas toinas, resolvemos fazer um estudo de caracterização estrutural da crotamina por espectroscopia de dicroísmo circular (CD) e espectrometria de ressonância magnética nuclear (RMN).Com o intuito de identificar as bases moleculares responsáveis pela atividade da crotamina e propor um possível modelo para sua interação com o canal de sódio e um possível mecanismo para sua atividade analgésica, investigamos as características estruturais da crotamina usando espectroscopia de dicroísmo circular e espectrometria de ) ressonância magnética nuclear e propomos a estrutura tridimensional da crotamina. Os escpectros d CD da crotamina no UV-distante em pHneutro mostram uma banda positiva peculiar em aproximadamente 221 nm, não usual entre proteínas globulares mas similar a outras neurotoxinas de cadeia curta, que é atribuída tanto a resíduos aromáticos como a pontes dissulfeto. Os perfis de desnaturação térmica observados até 95ºC revelaram que mudanças conformacionais reversíveis ocorrem acima de 70ºC, sem provocar completo desenovelamento. Estes dados sugerem uma importante função das pontes dissulfeto em manter a conformação nativa. De fato, os espectros no UV-próximo e no UV-distante da crotamina, quando as pontes estão reduzidas e carboximetiladas, indicam que a remoção das mesmas resulta na perda das estruturas secundária e terciária. Quando comparada a neurotoxinas de cadeia longa, a crotamina apresenta uma sensibilidade ao pH na faixa de pH de 4 a 7, que é revelado por um deslocamento de uma banda positiva de 221 para 225 nm. Como acontece com outras toxinas em temperatura ambiente, a crotamina exibe uma heterogeneidade conformacional, revelada por espectros de RMN com múltiplos conjuntos de ressonância por resíduo, que deseparece principalmente a 5ºC. Até o presente momento, as estruturas tridimensionais foram calculadas nessa temperatura, usando 568 restrições de distâncias não ambíguas, estabelecendo um modelo seqüencial. O enovelamento global da crotamina consiste de um cerne de três sgmentos em 'beta'-folha antiparalelos, uma pequena 'alfa'-hélice no N-terminal paralelo à 'beta'-folha, duas voltascompactas e uma volta de cinco resíduos. no conjunto, nós podemos identiicar um núcleo denso de estrutura secundária estabilizado por duas pontes disulfeto, enquanto que a terceira ponte conecta uma alça exposta na estrutura. As cadeias principais de dez estruturas selecionadas foram superpostas, ) ajustando-se os seguintes domínios de estrutura secundária 'Q IND.3'-'K IND.7', 'G IND.9'-'F IND.12', 'D IND.24'-'F IND.25', 'K IND.35'-'K IND.38', e os resultados mostram que esses domínios formam os elementos de estrutura secundária regular e exibem uma boa convergência estrutural. Contrariamente, as regiões 'P IND.13'-'S IND.23' e 'G IND.26'-'W IND.34' são pouco ordenadas. A análise do potencial eletrostático da crotamina revela uma superfície altamente positiva exposta ao solvente
- Imprenta:
- Publisher place: Ribeirão Preto
- Date published: 2001
- Data da defesa: 12.12.2001
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ABNT
MANCIN, Adriana Cristina. Aspectos estruturais e funcionais da crotamina nativa e quimicamente modificada. 2001. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2001. . Acesso em: 21 maio 2024. -
APA
Mancin, A. C. (2001). Aspectos estruturais e funcionais da crotamina nativa e quimicamente modificada (Tese (Doutorado). Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. -
NLM
Mancin AC. Aspectos estruturais e funcionais da crotamina nativa e quimicamente modificada. 2001 ;[citado 2024 maio 21 ] -
Vancouver
Mancin AC. Aspectos estruturais e funcionais da crotamina nativa e quimicamente modificada. 2001 ;[citado 2024 maio 21 ]
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