'beta'-D-galactofuranose: purificação da enzima de Penicillium fellutanum e sua detecção em Trypanossoma cruzi (2001)
- Authors:
- Autor USP: MILETTI, LUIZ CLAUDIO - IQ
- Unidade: IQ
- Sigla do Departamento: QBQ
- Subjects: TRYPANOSOMA CRUZI (BIOSSÍNTESE); CARBOIDRATOS (BIOSSÍNTESE); PENICILLIUM (BIOSSÍNTESE); DOENÇA DE CHAGAS; BIOLOGIA CELULAR
- Language: Português
- Abstract: A 'beta'-D-galactofuranose é um componente de várias macromoléculas de muitos organismos, incluindo bactérias, protozoários e fungos. Interessantemente este carboidrato não usual está ausente de glicoconjugados de mamíferos. Um método alternativo foi utilizado para purificar a 'beta'-D-galactofuranosidase utilizando p-nitrofenil-'beta'-galactofuranosídeo como substrato. O meio de cultura concentrado do fungo Penicillium fellutanum foi cromatografado em coluna de DEAE-Sepharose CL 6B, seguido de cromatografia em coluna de afinidade de 4-aminofenil-1-tio-'beta'-D-galactofuranosídeo-Sepharose, que permitiu a separação de dois picos com atividade enzimática após a cluição com D-galactônico-'gama'- lactona em um gradiente de 100 a 500 mM de NaCl. Os dois picos resultaram, quando analisados por SDS-PAGE, em um polipeptídeo de 70 kDa. Anticorpos produzidos contra a mistura das bandas recortadas do gel são capazes de imunoprecipitar 77% das unidades totais de enzima. Uma das bandas ecortadas foi submetida a microseqüenciamento, obtendo-se seqüências para 3 peptídeos (65, 73, 101). Anticorpos foram produzidos contra os peptídeos sintéticos e usados para imunoprecipitar um polipeptideo com atividade de 'beta'-D- galactofuranosidase. Para verificar a presença de 'beta'-D-galactofuranosidase em T. cruzi, usamos a mesma coluna de afinidade de 4-aminofenil-l-tio-'beta'-D-galactofuranosídeo-Sepharose. Um extrato de formas epimastigotas marcadas metabolicamentecom 35S-metionina foi aplicado na coluna de afinidade. A enzima foi eluída após a lavagem com D-galactônico-'gama'- lactona em um gradiente de NACL 100 a 500 mM. A análise por SDS- PAGE do material eluído mostrou um polipeptídeo de massa molecular aparente 50-60 kDa que é reconhecido por anticorpos anti-'beta'-D-galactofuranosidase. Os anticorpos reagem por imunoflorescência indireta também com parasitas fixados com paraformaldeído. ) O polipeptídeo de 50-60 kDa foi empregado em ensaios de atividade enzimática. Praticamente nenhuma atividade foi detectada utilizando-se p-nitrofenil-'beta'-D-galactofuranosídeo como substrato. A LPPG (lipopeptideofosfoglicana), um glicoconjugado isolado de epimastigotas de T. cruzi foi empregada como substrato. A galactopiranose, produto da hidrólise da atividade enzimática, foi detectada por cromatografia de troca iônica em alto pH sugerindo a presença de 'beta'-D-galactofuranosidase em T. cruzi
- Imprenta:
- Data da defesa: 05.10.2001
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ABNT
MILETTI, Luíz Cláudio. 'beta'-D-galactofuranose: purificação da enzima de Penicillium fellutanum e sua detecção em Trypanossoma cruzi. 2001. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo, São Paulo, 2001. Disponível em: https://teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-31012019-093632/. Acesso em: 15 maio 2024. -
APA
Miletti, L. C. (2001). 'beta'-D-galactofuranose: purificação da enzima de Penicillium fellutanum e sua detecção em Trypanossoma cruzi (Tese (Doutorado). Universidade de São Paulo, São Paulo. Recuperado de https://teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-31012019-093632/ -
NLM
Miletti LC. 'beta'-D-galactofuranose: purificação da enzima de Penicillium fellutanum e sua detecção em Trypanossoma cruzi [Internet]. 2001 ;[citado 2024 maio 15 ] Available from: https://teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-31012019-093632/ -
Vancouver
Miletti LC. 'beta'-D-galactofuranose: purificação da enzima de Penicillium fellutanum e sua detecção em Trypanossoma cruzi [Internet]. 2001 ;[citado 2024 maio 15 ] Available from: https://teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-31012019-093632/
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