Digestão ácida em diptera superiores (2003)
- Authors:
- Autor USP: ALMEIDA, ÉRIKA HOTZ - IQ
- Unidade: IQ
- Sigla do Departamento: QBQ
- Subjects: DIGESTÃO ANIMAL (ESTUDO); INSETOS (ESTUDO); BIOQUÍMICA ANIMAL; DIPTERA (ESTUDO)
- Language: Português
- Abstract: Insetos abrangem o maior número de espécies descritas, estando distribuídos por praticamente todos os nichos ecológicos. O tubo digestivo destes animais consiste na principal interface entre estes e o meio externo. Assim, o estudo das enzimas digestivas, ou proteínas relacionadas ao processo digestivo em insetos, faz-se fundamental para a tentativa de desenvolver novos métodos de controle que ajam via canal alimentar, como o uso de plantas transgênicas para controlar insetos fitófagos (Felton & Gatehouse, 1996). Diptera superiores são os únicos animais, além dos vertebrados, que apresentam uma região ácida em seu intestino médio (Vonk & Western, 1984). Assim, o estudo da digestão ácida nestes organismos permite-nos examinar em detalhe este interessante paralelismo evolutivo (muito revelador se incluir também aspectos moleculares). Para realização deste estudo foram escolhidas duas enzimas relacionadas com a digestão ácida em Diptera: uma aspártico-proteinase de Mosca doméstica, semelhante à catepsina D, e uma lisozima digestiva de Drosophila melanogaster. Para purificar a aspártico-proteinase intestinal de M. domestica, ventrículos anterior e médio de larvas deste inseto foram homegeneizados e centrifugados, sendo o sobrenadante resultante utilizado como fonte de enzima. A combinação de uma cromatografia em coluna de troca iônica seguida de uma filtração em gel mostrou-se como a melhor para a obtenção da aspártico-proteinase intestinal de larvas de M.domestica totalmente pudficada. Clones de lisozima de D. melanogaster (LysD) e de A. darlingi (Lysdar) foram utilizados na construção de vetares de expressão a seguir usados na transformação de E. coli linhagem OrigamiTm B (DE3) e P. Plastoris GS115 (his4). As bactérias transformadas com vetor pT7-dar (que continha a gene Lysdar), quando induzidas por IPTG, foram capazes de expressar uma proteína, cujo peso molecular em gel de SDS-PAGE é de cerca de 14 kDa, como ) o esperado. A lisozima hipotética foi encontrada em corpos de inclusão, que solubilizados por SDS ´3 POR CENTO´ resultaram em proteína inativa. Colônias de P. pastoris transformadas com o vetor pPIC-9-D (contendo o gene LysD) foram submetidas a reação em cadeia com DNA polimerase. Aquelas que geraram produtos de PCR de tamanho coerente com o de uma lisozima foram cultivadas e posteriormente, induzidas por metanol. P. pastoris é capaz de secretar a lisozima induzida. Assim, alíquotas do meio de indução foram utilizadas em ensaios enzimáticos para a detecção da atividade da lisozina intestinal de D. melanogaster. A lisozima é expressa em P. pastoris em grande quantidade (12 mg/L) e com atividade preservada. Foi verificado que há uma íntima relação entre a força iônica do meio e o pH ótimo da lisozima intestinal recombinante de D. melanogaster. O pH ótimo é deslocado para valores mais ácidos quando em forças iônicas maiores. Em contrapartida, os valores de atividade obtidos para a lisozima Drecombinante de D. melanogaster decrescem com o aumento da força iônica do meio. Foi verificado ainda que a força iônica influi na constante de Michaelis-Menten (Km) da lisozima intestinal recombinante de D. melanogaster, o valor do Km aumenta conforme a força iônica do meio torna-se maior. Estes dados estão de acordo com os observados por Regel et al, 1998, para a lisozima intestinal isolada de larvas de D. melanogaster
- Imprenta:
- Data da defesa: 10.03.2003
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ABNT
ALMEIDA, Érika Hotz. Digestão ácida em diptera superiores. 2003. Dissertação (Mestrado) – Universidade de São Paulo, São Paulo, 2003. Disponível em: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-18092015-160208/. Acesso em: 03 jun. 2024. -
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Almeida, É. H. (2003). Digestão ácida em diptera superiores (Dissertação (Mestrado). Universidade de São Paulo, São Paulo. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-18092015-160208/ -
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Almeida ÉH. Digestão ácida em diptera superiores [Internet]. 2003 ;[citado 2024 jun. 03 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-18092015-160208/ -
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