Caracterização de novos genes humanos envolvidos no processo de regulação da expressão de genes homeóticos (2004)
- Authors:
- Autor USP: NUNES, DIANA NORONHA - IQ
- Unidade: IQ
- Sigla do Departamento: QBQ
- Subjects: EXPRESSÃO GÊNICA; GENOMAS; GENES (CARACTERÍSTICAS); REGULAÇÃO GÊNICA
- Language: Português
- Abstract: A identidade na segmentação do corpo de diversos organismos, durante o desenvolvimento, é devida, em grande parte, à ação das proteínas homeóticas. Em especial, dois grupos de proteínas, Trithorax (trxG) e Polycomb (PcG) têm um papel fundamental na manutenção, respectivamente, da ativação e da repressão da transcrição gênica, associando-se à cromatina. A importância das PcG nos estimulou a buscar a caracterização das proteínas humanas ortólogas ao "Enhancer of Polycomb"(EPc) de Drosophila, até então não descritas no genoma humano. Para tanto, buscamos: - obter a sequência completa e mapear o cDNA do novo gene humano homólogo ao "Enhancer of Polycomb" de Drosophila; - analisar sua expressão em tecidos fetais, adultos e tumorais e fazer estudos buscando sua caracterização funcional. Encontramos, mapeamos e obtivemos a seqüência completa de dois genes humanos, ortólogos de Epc1 (10p11-22) e de Epc2 (2q21-23) de camundongo, publicando estes dados em 2001 (Camargo et al., 2001). Ambos os genes são bastante conservados entre várias espécies, sendo que o cDNA de hEPC2 humano, por exemplo, é 94´POR CENTO` idêntico ao Epc2 de camundongo e possui 96´POR CENTO` de identidade ao nível de proteína, sugerindo que a função do gene deve ter sido mantida durante a evolução. No entanto, as seqüências protéicas de. hEPC1 e hEPC2 humanos possuem apenas 68´POR CENTO` de identidade entre si. Portanto, é provável que após a duplicação dos parálogos, estes tenham divergido funcionalmente. Aexpressão de ambos os genes foi avaliada utilizando "dot-blots" contendo 76 mRNAs de amostras de tecidos fetais, adultos e tumorais, mostrando-se fraca e ubíqua. Análises in silico sugeriram a existência de 4 isoformas de splicing para hEPC2, as quais foram validadas por RT-PCR ou "Northern blots". Uma das isoformas (de 2.7 Kpb) se mostrou mais abundante em todas as linhagens tumorais estudadas através de análises de "Northern blot", ) principalmente nas linhagens de linfoma de Burkitt's Raji e na linhagem de leucemia pró-mielocítica HL-60. Esta isoforma é gerada através de um sítio alternativo de poli-adenilação, que reduz sua porção 3´LINHA`UTR, retirando 4 dos 5 "elementos ricos em adenilatos e uridilatos" (AREs), envolvidos com a degradação de mRNAs lábeis que codificam proteínas regulatórias. Estes resultados se encontram em um manuscrito recentemente submetido à publicação (anexo à tese). Interação entre hEPC2 e SMADs e sua modulação por TGF-´BETA`. Durante a montagem da seqüência completa de hEPC2, verificamos que duas ESTs patenteadas mostravam alta identidade com o gene. Estas seqüências foram descritas como sendo parte de uma nova proteína de interação com as proteínas da família SMAD, envolvidas com transdução de sinais desencadeados por TGF-´BETA`. Esta citocina por sua vez, regula a proliferação, diferenciação e morte celular. Partimos para a avaliação da possível interação entre hEPC2 e as SMADs, em colaboração com o grupo do Dr. Aristidis Moustakas, doLudwig Institute for Cancer Research de Uppsala, Suécia. Os resultados de co-imunoprecipitação sugeriram que as SMADs 2, 3, 4, 7 e 8 interagem com hEPC2, sendo que a interação entre as SMAD2, SMAD3, SMAD4 e hEPC2 nas células tratadas com TGF-´BETA`1, mostraram uma redução na co-imunoprecipitação. Este resultado sugere que TGF-´BETA´1 modula negativamente a interação entre essas proteínas. Da mesma maneira, foi observada uma redução na interação de hEPC2 com SMAD8 após o tratamento com BMP-7. Esse resultado é ainda mais destacado para as SMADs 2 e 3. Estes dados foram observados para ambas as construções de hEPC2, o que sugere fortemente a veracidade da interação entre estas proteínas. A localização celular de hEPC2, e também sua co-localização com SMAD2 foram investigadas através de imunofluorescência indireta e confirmaram a predição do programa PSORTII, ) de que hEPC2 se localiza no núcleo. No entanto, não foi possível observar a co-Iocalização entre hEPC2 e SMAD2. É possível que hEPC2 não se ligue diretamente ao DNA, necessitando se associar como parceiro de um fator de transcrição. Esta foi uma das hipóteses para a atuação de hEPC2, como um co-fator que se associe com uma das SMADs e se ligue a um elemento específico de ligação a SMAD (SBE). Para investigar essa hipótese um ensaio de gene repórter foi feito utilizando uma construção de um repórter contendo 12 repetições da seqüência CAGA (seqüência específica de ligação das SMADs 2, 3 e 4) fusionadocom o gene da luciferase. No entanto, este ensaio não demonstrou que a transcrição de SMAD2 é dependente de hEPC2 e o experimento deverá ser repetido. Para confirmar a interação entre hEPC2 e as SMADs, será feito um experimento de pull-down. Para tal o cDNA de hEPC2 foi clonado no vetor pET-32A de expressão indutível em bactérias. A proteína recombinante já foi produzida, tendo sido induzida e posteriormente purificada em condições desnaturantes. Apesar de dezenas de genes PcG terem sido caracterizados em Drosophila, poucos destes genes foram estudados em mamíferos. Portanto, a descrição do gene hEPC2 e seus transcritos alternativos, contribui para o conhecimento de PcG humanos, indicando a associação de maior expressão de uma de suas isoformas em linhagens celulares tumorais. Em relação à interação de hEPC2 com as SMADs, é interessante observar que nenhuma outra proteína foi descrita por possuir a particularidade de interagir com as SMADs de diferentes categorias. Talvez este seja um dado importante, que indique o papel singular de hEPC2 na sinalização de TGF-´BETA`1.
- Imprenta:
- Data da defesa: 03.09.2004
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ABNT
NUNES, Diana Noronha. Caracterização de novos genes humanos envolvidos no processo de regulação da expressão de genes homeóticos. 2004. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo, São Paulo, 2004. Disponível em: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-28112014-152127/. Acesso em: 21 maio 2024. -
APA
Nunes, D. N. (2004). Caracterização de novos genes humanos envolvidos no processo de regulação da expressão de genes homeóticos (Tese (Doutorado). Universidade de São Paulo, São Paulo. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-28112014-152127/ -
NLM
Nunes DN. Caracterização de novos genes humanos envolvidos no processo de regulação da expressão de genes homeóticos [Internet]. 2004 ;[citado 2024 maio 21 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-28112014-152127/ -
Vancouver
Nunes DN. Caracterização de novos genes humanos envolvidos no processo de regulação da expressão de genes homeóticos [Internet]. 2004 ;[citado 2024 maio 21 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-28112014-152127/
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