Distribuição e caracterização cinética de proteases no ventrículo de larvas de Lucilia cuprina (Diptera, Calliphoridae) (2004)
- Authors:
- Autor USP: CRUZ, CARLOS EDUARDO SILVA DA - IB
- Unidade: IB
- Sigla do Departamento: BIF
- Subjects: DIPTERA; LARVA; ENZIMAS
- Language: Português
- Abstract: Insetos califorídeos estão envolvidos na formação de miíases cutâneas, principalmente em bovinos e ovinos. Algumas enzimas destes insetos já foram purificadas e caracterizadas cineticamente, a fim de elucidar a especificidade a diferentes substratos e o seu mecnaismo de hidrólise de componentes da matriz extracelular. Pouco é conhecido acerca das propriedades cinéticas das hidrolases digestivas em larvas de Lucilia cuprina. Neste trabalho investigamos a atividade e distribuição de endo- e ectopeptidases nas regiões luminal e epitelial do intestino médio destas larvas. Os ensaios foram realizados em ventrículos inteiros e divididos em três regiões. Todas as proteases foram inibidas em fígado fresco. Ensaios subsequentes, realizados em homogeneizado de ventrículos de larvas crescidas em fígado dessecado, apresentaram valores bem maiores. A distribuição das enzimas em frações solúveis e associadas à membranas não se alterou em decorrência de inibição enzimática. No ventrículo inteiro, as enzimas mais abundantemente expressas foram aminopeptidase, seguido de quimotripsina, carboxipeptidase, tripsina, dipeptidase e elastase. As aminopeptidases são quase que exclusivamente associadas à membrana plasmática, pois nenhuma atividade foi encontrada em frações solúvies através de centrifugação diferencial. Carboxipeptidase, tripsina, quimotripsina, elastase e dipeptidase aprsentam atividade específica em ambas as frações. Elastase demonstrou baixa atividade emtodas as preparações. Califorídeos também apresentam variações de pH em regiões diferentes do ventrículo. A menor atividade de algumas proteases encontradas na região média pode ser devido ao pH ácido desta região. O ventrículo posterior é a região aonde ocorre a maior parte do processo digestivo. As aminopeptidases associadas à frações de membrana foram solubilizadas com papaína. Este tratamento gerou uma solubilização de 54% e recuperação de 97%. A partir deste material, duas aminopeptidases (AP-1 e AP-2) foram isoladas através de cromatografia de troca iônica em sistema de baixa pressão (Econosystem). As atividades enzimáticas de AP-1 e AP-2 foram determinadas em diferentes valores de pH. As atividades máximas para AP-1 e AP-2 foram encontradas em valores de pH em torno de 7.6 e 7.5, respectivamente. As taxas de inatividade das duas aminopeptidases a '55 GRAUS' seguiram uma cinética aparente de primeira ordem, e são distintas, com meias-vidas de 7 a 35 minutos, respectivamente. Os valores de Km e Vmax foram determinados para estas enzimas usando AlapNA, LeupNA e ArgpNA. A relação Vmax/Km indica a preferência desta enzima por um substrato específico. AP-1 e AP-2 hidrolizaram os substratos testados na seguinte ordem de preferência: Arg > Ala > Leu > e Leu > Ala > Arg, respectivamente, demonstrando que estas formas enzimáticas apresentam especificidades diferentes. AP-1 e AP-2 foram ensaiadas na presença de bestatina, hidroxamato deleucina e hidroxamato de arginina. Os valores de Ki obtidos demonstram que a bestamina inibe AP-1 mais eficiente do que AP-2. Hidroxamato de arginina apresentou uma menor inibição comparada ao hidroxamato de leucina. Os valores de pK dos grupos prototrópicos do complexo enzima-substrato foram de 6.2 e 8.4 para AP-1, e 6.4 e 8.3 para AP-2. Os valores de pK para os grupos prototrópicos da enzima livre foram de 6.9 e 7.8 para AP-1, e 6.5 e 7.8 para AP-2. Uma dipeptidase que hidrolisa Gly-Leu também foi encontrada associada à frações de membrana e não foi solubilizada por papaína. Através de inativação térmica, esta dipeptidase apresentou uma meia vida de 36 minutos e um pH ótimo em torno de 8.0. O estudo cinético destas enzimas pode contribuir para a elucidação dos mecanismos de hidrólise de diferentes substratos in vivo e in vitro, bem como compreender a evolução do ectoparasitimo nestas espécies.
- Imprenta:
- Data da defesa: 14.09.2004
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ABNT
CRUZ, Carlos Eduardo Silva da. Distribuição e caracterização cinética de proteases no ventrículo de larvas de Lucilia cuprina (Diptera, Calliphoridae). 2004. Dissertação (Mestrado) – Universidade de São Paulo, São Paulo, 2004. . Acesso em: 13 maio 2024. -
APA
Cruz, C. E. S. da. (2004). Distribuição e caracterização cinética de proteases no ventrículo de larvas de Lucilia cuprina (Diptera, Calliphoridae) (Dissertação (Mestrado). Universidade de São Paulo, São Paulo. -
NLM
Cruz CES da. Distribuição e caracterização cinética de proteases no ventrículo de larvas de Lucilia cuprina (Diptera, Calliphoridae). 2004 ;[citado 2024 maio 13 ] -
Vancouver
Cruz CES da. Distribuição e caracterização cinética de proteases no ventrículo de larvas de Lucilia cuprina (Diptera, Calliphoridae). 2004 ;[citado 2024 maio 13 ]
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