Caracterização molecular da proteína Ddl-2 e mapeamento de seus domínios de interação com proteína fosfatase do tipo-1 de Dictyostelium discoideum (2005)
- Authors:
- Autor USP: CANAVEZ, JULIANA MOREIRA DE SOUSA - IQ
- Unidade: IQ
- Sigla do Departamento: QBQ
- Subjects: BIOLOGIA MOLECULAR; MAPEAMENTO GENÉTICO; PROTEÍNAS (CARACTERÍSTICAS)
- Language: Português
- Abstract: A serina/treonina fosfatase do tipo 1 (PP1) é uma enzima ubíqua nas células e nos tecidos das várias espécies em que foi pesquisada e regula vários processos como metabolismo intermediário, processamento de mRNA, transcrição e apoptose. Geralmente a holoenzima PP1 é encontrada como um dímero constituído por uma subunidade catalítica conservada (PP1c) e uma ou mais subunidades reguladoras variáveis. Em mamíferos, já foram identificados mais de 50 polipeptídeos que se associam direta ou indiretamente a PP1c, gerando holoenzimas com localizações celulares e especificidades distintas. Entre estas proteínas estão inibidores citosólicos de PP1c, tais como o inibidor-1 (I-1), o inibidor-2 (I-2) e o inibidor nuclear da PP1 (NIPP-1). Ortólogos do I-2 foram descritos em microorganismos como Saccharomyces cerevisiae e Neurospora crassa. Neste trabalho nós demonstramos que o genoma da ameba social Dictyostelium discoideum possui uma única cópia do gene que codifica um ortólogo do I-2 (Ddl-2). Análise através de Northern blot mostrou que o mRNA de Ddl-2 é expresso durante o crescimento e ao longo de todo o ciclo de desenvolvimento, com níveis variáveis. Também demonstramos que o gene Ddl-2 codifica uma verdadeira proteína inibidora da PP1c uma vez que seu produto recombinante em bactéria é capaz de inibir, com eficácia equivalente, as atividades de fosforilase fosfatase das PP1c recombinantes selvagem (DdPP1c) e mutante (DdPP1cF269C) de D. discoideum e NcPP1c de N.crassa in vitro. A proteína DdPP1cF269C apresenta características distintas da DdPP1c incluindo maior estabilidade, maior atividade de fosforilase fosfatase e maior sensibilidade frente ao inibidor caliculina A. Estas diferenças devem-se a substituição da cisteína conservada da posição 269 por uma fenilalanina, que é verificada na enzima selvagem. DdPP1c e DdPP1cF269C foram também ensaiadas na presença de INc-1L e INc-1 que são ortólogos de I-2 em N. crassa. ) Ambas as proteínas recombinantes purificadas exibiram efeito inibidor sobre a atividade de fosforilase fosfatase das DdPP1c recombinantes selvagem e mutante, sendo que INc-1 foi um inibidor duas vezes mais eficiente que INc-1L. Este efeito pode ser devido a um segmento de 38 aminoácidos codificado por um íntron em fase que é retido na isoforma INc-1L. Nossos dados indicam ainda que a mutação F269C não afetou a sensibilidade da DdPP1c recombinante a nenhum dos ortólogos de I-2 testados in vitro. Ensaios de duplo-híbrido utilizando a PP1c selvagem e mutante de D. discoideum (DdPP1c e DdPP1cF269C) e de N. crassa (NcPP1c) como iscas e Ddl-2 como presa mostraram que estas proteínas interagiram in vivo. Quando a presa era o INc-1L ou INc-1 a interação ocorreu apenas com a NcPP1c, sendo mais forte no caso de INc-1. As regiões de Ddl-2 envolvidas na interação física com a DdPP1c foram mapeadas através da expressão de proteínas truncadas no ensaio de duplo híbrido. Os experimentos apontaram que ocarbóxi-terminal de ´APROXIMADAMENTE`100 aminoácidos não é essencial para a interação, mas que o somatório das diversas regiões responde pela integridade da interação
- Imprenta:
- Data da defesa: 04.02.2005
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ABNT
SOUSA-CANAVEZ, Juliana Moreira. Caracterização molecular da proteína Ddl-2 e mapeamento de seus domínios de interação com proteína fosfatase do tipo-1 de Dictyostelium discoideum. 2005. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo, São Paulo, 2005. Disponível em: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-08022007-144340/. Acesso em: 11 jun. 2024. -
APA
Sousa-Canavez, J. M. (2005). Caracterização molecular da proteína Ddl-2 e mapeamento de seus domínios de interação com proteína fosfatase do tipo-1 de Dictyostelium discoideum (Tese (Doutorado). Universidade de São Paulo, São Paulo. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-08022007-144340/ -
NLM
Sousa-Canavez JM. Caracterização molecular da proteína Ddl-2 e mapeamento de seus domínios de interação com proteína fosfatase do tipo-1 de Dictyostelium discoideum [Internet]. 2005 ;[citado 2024 jun. 11 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-08022007-144340/ -
Vancouver
Sousa-Canavez JM. Caracterização molecular da proteína Ddl-2 e mapeamento de seus domínios de interação com proteína fosfatase do tipo-1 de Dictyostelium discoideum [Internet]. 2005 ;[citado 2024 jun. 11 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-08022007-144340/
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