Clonagem do cDNA que codifica a enzima mio-inositol oxigenase (ec 1.13.99.1) de Arabidopsis thaliana e modulação da expressão do gene via anti-sense EM plantas de Nicotiana tabacum L (2005)
- Authors:
- Autor USP: NASCIMENTO, DANIELA DEFAVARI DO - ESALQ
- Unidade: ESALQ
- Sigla do Departamento: LGN
- Subjects: AGROBACTERIUM; CLONAGEM; CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS; DESENVOLVIMENTO VEGETAL; DNA; FUMO; MELHORAMENTO GENÉTICO VEGETAL
- Language: Português
- Abstract: Muitos dos açúcares precursores de hemiceluloses, como UDP-arabinose, UDP-xilose, ácido UDP-galacturônico, UDP-apiose e derivados metilados são provenientes de um precursor comum, o UDP-glucuronato. A síntese de UDP-glucuronato é mediada pela enzima UDP-glicose desidrogenase a partir de UDP-glicose, entretanto, existe uma rota biossintética secundária, a rota de oxidação do inositol, cujos passos regulatórios são pouco conhecidos. A alteração do metabolismo do mio-inositol nas plantas tem despertado grande interesse em razão de sua participação em vários processos metabólicos. Uma vez produzido, o mio-inositol pode seguir várias rotas metabólicas (Loewus & Loewus, 1983) ou ser oxigenado pela enzima mio-inositol oxigenase, formando ácido glucurônico. Essa reação é irreversível e o produto formado pode ser diretamente transferido para a síntese da parede celular ou ser fosforilado pela enzima glucuroquinase. Este trabalho teve como objetivo clonar o cDNA do gene miox que codifica a enzima mio-inositol oxigenase (EC 1.13.99.1) para modulação da sua expressão, via anti-sense, em plantas de tabaco. A estratégia de clonagem iniciou-se com a busca de genes no banco de dados do NCBI. A seqüência ortóloga da espécie vegetal encontrada, com alto grau de homologia com o gene de Sus scrofa (primeira espécie a ter o gene seqüenciado e caracterizado) foi a de Arabidopsis thaliana. Assim, a seqüência de nucleotídeos dessa, foi utilizada para a confecção dos primers para a ORFdo gene da mio-Inositol oxigenase, contendo a sequência de direcionamento CACC no primer 3' (para clonagem direcional anti-sense do gene). Realizou-se o isolamento do gene miox de A. thaliana através da extração de mRNA desta espécie, que foi em seguida, submetido a reação de RT-PCR com primers específicos para a ORF do gene Esse produto da reação RT-PCR foi usado como sonda na análise de Southern blot e para clonagem do gene. Para a clonagem, foi necessário primeiro clonar o produto da reação RT-PCR no vetor TOPO seguida de transformação química de células competentes de Escherichia coli (TOP 10). Em seguida, procedeu-se a reação LR clonase para clonagem no vetor binário de transformação de plantas (Gateway - Invitrogen), seguido de transformação química de células competentes de E. coli (DH5 ). A transformação da linhagem EHA105 de Agrobacterium tumefaciens, com o plasmídio Gateway recombinante (pK7WG2D/anti-sense-miox) foi feita por eletroporação e os clones recombinantes foram selecionados. A transformação de plantas de tabaco foi realizada por infecção de discos foliares com o clone de A. tumefaciens (EHA105) que contém o transgene. A confirmação da presença do transgene nos brotos transformantes foi feita por análise de PCR, com primers do gene nptII, de resistência à canamicina. Essas plantas transgênicas foram cultivadas, sob condições de ambiente controlado, para produção de sementes e posterior avaliação da progênie,quanto à segregação do gene de resistência à canamicina. A expressão do transgene na progênie T2, foi avaliada por RNA Slot blot e através de quantificação dos componentes da parede celular, como carboidratos, lignina e ácidos urônicos. A expressão do gene miox anti-sense das plantas transgênicas causou acúmulo de arabinose e de ácido glucurônico no caule destas plantas
- Imprenta:
- Publisher place: Piracicaba
- Date published: 2005
- Data da defesa: 25.05.2005
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ABNT
NASCIMENTO, Daniela Defávari do. Clonagem do cDNA que codifica a enzima mio-inositol oxigenase (ec 1.13.99.1) de Arabidopsis thaliana e modulação da expressão do gene via anti-sense EM plantas de Nicotiana tabacum L. 2005. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo, Piracicaba, 2005. Disponível em: https://teses.usp.br/teses/disponiveis/11/11137/tde-20200111-122201/. Acesso em: 03 maio 2024. -
APA
Nascimento, D. D. do. (2005). Clonagem do cDNA que codifica a enzima mio-inositol oxigenase (ec 1.13.99.1) de Arabidopsis thaliana e modulação da expressão do gene via anti-sense EM plantas de Nicotiana tabacum L (Tese (Doutorado). Universidade de São Paulo, Piracicaba. Recuperado de https://teses.usp.br/teses/disponiveis/11/11137/tde-20200111-122201/ -
NLM
Nascimento DD do. Clonagem do cDNA que codifica a enzima mio-inositol oxigenase (ec 1.13.99.1) de Arabidopsis thaliana e modulação da expressão do gene via anti-sense EM plantas de Nicotiana tabacum L [Internet]. 2005 ;[citado 2024 maio 03 ] Available from: https://teses.usp.br/teses/disponiveis/11/11137/tde-20200111-122201/ -
Vancouver
Nascimento DD do. Clonagem do cDNA que codifica a enzima mio-inositol oxigenase (ec 1.13.99.1) de Arabidopsis thaliana e modulação da expressão do gene via anti-sense EM plantas de Nicotiana tabacum L [Internet]. 2005 ;[citado 2024 maio 03 ] Available from: https://teses.usp.br/teses/disponiveis/11/11137/tde-20200111-122201/
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