Caracterizaçao parcial dos sítios de fosforilação da enzima glicogênio sintase de Neurospora crassa (2007)
- Authors:
- Autor USP: BARBOSA, LUIZ CARLOS BERTUCCI - FMRP
- Unidade: FMRP
- Sigla do Departamento: RBI
- Subjects: PROTEÍNAS; BIOQUÍMICA
- Language: Português
- Abstract: A enzima glicogênio sintase (GS) catalisa o passo regulatório da síntese de glicogênio transferindo resíduos de glicose a partir de UDP-glicose a uma cadeia polissacarídica pré-existente. Esta enzima é regulada por fosforilação reversível e pelo modulador alostérico glicose-6-fosfato (G6P). Embora muitas seqüências codificando diversas GS tenham sido descritas até o momento, apenas a enzima de músculo de coelho e a Gsy2p da levedura Saccharomyces cerevisiae tiveram seus sítios de fosforilação bem caracterizados. Nosso laboratório isolou o cDNA que codifica a enzima do fungo Neurospora crassa e a seqüência da proteína (GSN) foi deduzida. Baseado em um alinhamento de seqüências de diferentes GS, quatro potenciais sítios de fosforilação foram identificados na enzima GSN: Ser632, Ser636, Thr641 e Thr645. Neste trabalho, utilizando a técnica de mutagênese sítio-dirigida por PCR, um banco de cDNAs gsn mutantes que codificam proteínas glicogênio sintases contendo mutações pontuais nos potenciais sítios de fosforilação foi construído. As proteínas GSN selvagem, mutantes e GSN'delta'6624 (isoforma truncada no aminoácido Glu624) foram produzidas em E. coli, fosforiladas in vitro com extrato celular bruto da linhagem de N. crassa RP-1 (deficiente na glicogênio sintase) e analisadas em relação à incorporação de fosfato radioativo. Os quatro resíduos mostraram ser fosforilados uma vez que todos os mutantes apresentaram diminuição na incorporação de fosfato em relaçãoà proteína selvagem. A proteína GSN'delta'624, apesar de não possuir a região C-terminal que compreende os resíduos de aminoácidos mutados apresentou incorporação de fosfato. Este resultado nos levou a considerar a hipótese da existência de sítios de fosforilação fora da região C-terminal. Levando isso em consideração foram obtidos os cDNAs gsn'delta'450 e gsn'delta'300, os quais codificam proteínas GSN truncadas nos aminoácidos IIe450 e Gly300, respectivamente. As proteínas truncadas foram produzidas em E. coli e serão analisadas em relação à incorporação de fosfato radioativo. Finalmente, foi avaliada a influência da via de sinalização mediada por AMPc na fosforilação da GSN utilizando duas maneiras distintas: fosforilação pela PKA comercial e por extratos celulares brutos de linhagens do fungo mutantes nesta via de sinalização. A GSN mostrou ser fosforilada in vitro pela subunidade catalítica da PKA em uma reação dependente da concentração da enzima quinase e do substrato GSN. Além disso, a GSN foi diferentemente fosforilada pelos extratos celulares das linhagens mutantes do fungo, em comparação ao extrato da linhagem RP-1; enquanto que a incorporação de fosfato foi diminuída na presença do extrato da linhagem mutante cr-1 (deficiente na atividade adenilato ciclase), a incorporação foi aumentada quando utilizado o extrato da linhagem mutante mcb (deficiente na subunidade regulatória da PKA)
- Imprenta:
- Publisher place: Ribeirão Preto
- Date published: 2007
- Data da defesa: 20.12.2007
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ABNT
BARBOSA, Luiz Carlos Bertucci. Caracterizaçao parcial dos sítios de fosforilação da enzima glicogênio sintase de Neurospora crassa. 2007. Dissertação (Mestrado) – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2007. . Acesso em: 21 maio 2024. -
APA
Barbosa, L. C. B. (2007). Caracterizaçao parcial dos sítios de fosforilação da enzima glicogênio sintase de Neurospora crassa (Dissertação (Mestrado). Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. -
NLM
Barbosa LCB. Caracterizaçao parcial dos sítios de fosforilação da enzima glicogênio sintase de Neurospora crassa. 2007 ;[citado 2024 maio 21 ] -
Vancouver
Barbosa LCB. Caracterizaçao parcial dos sítios de fosforilação da enzima glicogênio sintase de Neurospora crassa. 2007 ;[citado 2024 maio 21 ]
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