Estudo da multiplicidade de formas de ß-glicosidases de Aspergillus versicolor (2008)
- Authors:
- Autor USP: SOMERA, ALEXANDRE FAVARIN - FFCLRP
- Unidade: FFCLRP
- Sigla do Departamento: 592
- Subjects: ASPERGILLUS; FUNGOS (FISIOLOGIA); BIOQUÍMICA
- Language: Português
- Abstract: Este trabalho procurou avaliar algumas glicoformas, encontradas em Aspergillus versicolor, envolvidas com o processo de degradação de polissacarídeos da parede celular vegetal. Duas beta-xilosidases foram purificadas por meio de DEAE-celulose e precipitação com sulfato de amônia. Ambas mostraram-se enzimas que, quando deglicosiladas por PNGaseF, apresentaram mesmos mapas trípticos. A glicosilação sensível a EndoH mostrou-se importante para a manifestação de diferenças bioquímicas relacionadas às interações com ambiente eletrolítico adjacente, visto as mudanças das curvas de pH e alterações de comportamento frente a sais de íons metálicos registradas. A glicosilação também mostrou-se relevante a manutenção do funcionamento das enzimas, uma vez que deglicosilação por PNGaseF eliminou qualquer atividade remanescente. Também foi verificado que as diferentes formas glicosiladas periplásmicas são produzidas em meios distintos (xilana e xilose), cujos pH finais corresponderam aos pH das enzimas encontradas. Por meio de zimogramas, verificou-se que estas não eram produzidas de imediato, mas selecionadas ao longo do tempo de cultivo. Esta seleção foi inicialmente independente do pH, visto este, mesmo tamponado, ser corrigido pelo fungo, de modo a se apresentar, ao final de 48h, correlato com o da enzima selecionada. Exame cromatográfico em Concanavalina-A das enzimas deglicosiladas por EndoH mostraram que a oriunda de xilana tem aporte maior de ramificaçõesbiantenárias, que são ricas em galactose. Ambas apresentaram mapas trípticos iguais. A beta-xilosidase induzi da por xilana apresentou proporções de manos e, galactose e glucose iguais a 69,68 : 30,25 : 0,056 %, respectivamente, enquanto que beta-xilosidase induzida por xilose apresentou proporções iguais a 85,35 : 14,54 : 0,094%, respectivamente, resultado que corrobora com a resultado anterior.Duas beta-glucosidases de superficie micelial foram ) purificadas por meio de DEAE-Sephacel e DEAE-celulose. Ambas mostraram-se mais semelhantes entre si que as beta-xilosidases, e independentes de fonte de carbono ou pH. No entanto, apresentaram diferenças frente à inibição por celobiose (acentuada a partir de 10mM parabeta-glucosidase I e 20mM para beta-glucosidase II) e, embora sutis, a pH. Após serem submetidas a 45 GRAUSC por 30min (temperatura que induziu segunda conformação estável) mostraram curvas de pH muito distintas, que foram eliminadas nas enzimas submetidas ao mesmo experimento após deglicosilação por PNGaseF. Ambas apresentaram mapas trípticos iguais. A beta-glucosidase I mostrou-se constituída de Man:Gal:Glu em proporções iguais a 78,36%:21,61%:0,033% do carboidrato total, respectivamente, e a beta-glucosidase II, Man:Gal:Glu iguais a 83,59%:16,38%:0,028%, respectivamente. Ambas também apresentaram sinergismo quando juntas. Sobre celobiose, foi verificado apenas em pH acima de 5,5. Sobre celooligossacarídeos,manifestou-se em pH 5,25. A beta-glucosidase I foi menos ativa que a beta-glucosidase II quando em ausência de glucose e celobiose na solução de reação inicial, situação na qual o contrário foi verdadeiro. O sinergismo foi drasticamente eliminado após deglicosilação por PNGaseF. Não se sabe se este resultado foi oriundo de mudanças cinéticas provocadas pela deglicosilação ou de uma possível eliminação de agregação anteriormente existente entre glicosiladas. Curvas de absorbância entre 200 e 30Onm não apontaram existência de interação entre as duas enzimas, glicosiladas ou deglicosiladas. O componente beta-glicosidásico extracelular foi purificado por meio de DEAE- Sephacel e Octyl-Sepharose e se revelou um heteroagregado de fosfatase ácida com beta-glicosidase, que se mostrou estável e ativo em ampla gama de temperaturas e pH, com ótimos de 55 GRAUSC e 5,5, respectivamente. Entretanto, os perfis das ) das curvas foram distintos entre as enzimas componentes. Somente concentrações superiores a 0,8mM CoCl IND.2 apresentaram efeito desagregador, podendo ser empregadas em conjunto com DEAE- celulose para purificação das enzimas isoladas. Quando separadas, fosfatase mostrou-se 260% mais ativa e beta-glicosidase, 50% menos ativa. Nesta condição, as faixas de pH se restringiram, acidificando-se, localizando-se entre pH 4,0 e 5,5. Aparentemente, a agregação reforça a atividade celobiásica. A fosfatase foi ativa sobre farelo de trigo e fitato de sódio e adsorveufortemente em farelo de trigo. A beta-glicosidase apresentou atividade sobre rareio de trigo, xilana e Avicel (liberando apenas glicose desta última), revelando-se enzima com atividade celobioidrolásica inespecífica, embora ávida por celobiose. As atividades de cada enzima foram determinadas como oriundas de um único sítio catalítico. beta-glicosidase não foi seqüestrada por farelo de trigo quando desagregada, mas adsorveu no material quando agregada ou reagregada à fosfatase. O seqüestro por farelo de trigo, aparentemente, deveu-se a interações entre sítio catalítico da fosfatase e o substrato de adsorção
- Imprenta:
- Publisher place: Ribeirão Preto
- Date published: 2008
- Data da defesa: 12.03.2008
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ABNT
SOMERA, Alexandre Favarin. Estudo da multiplicidade de formas de ß-glicosidases de Aspergillus versicolor. 2008. Dissertação (Mestrado) – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2008. Disponível em: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/59/59139/tde-09042008-171700/. Acesso em: 21 maio 2024. -
APA
Somera, A. F. (2008). Estudo da multiplicidade de formas de ß-glicosidases de Aspergillus versicolor (Dissertação (Mestrado). Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/59/59139/tde-09042008-171700/ -
NLM
Somera AF. Estudo da multiplicidade de formas de ß-glicosidases de Aspergillus versicolor [Internet]. 2008 ;[citado 2024 maio 21 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/59/59139/tde-09042008-171700/ -
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Somera AF. Estudo da multiplicidade de formas de ß-glicosidases de Aspergillus versicolor [Internet]. 2008 ;[citado 2024 maio 21 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/59/59139/tde-09042008-171700/
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