Caracterização bioquímica e imunológica das enzimas recombinantes ATP-difosfohidrolases 1 e 2 do parasita Schistosoma mansoni (2008)
- Authors:
- Autor USP: GARCIA, JULIO CESAR LEVANO - IQ
- Unidade: IQ
- Sigla do Departamento: QBQ
- Subjects: PROTEÍNAS RECOMBINANTES (CARACTERÍSTICAS;IMUNOLOGIA); SCHISTOSOMA (ESTUDO); EXPRESSÃO GÊNICA (ESTUDO); CLONAGEM (ESTUDO); ANTÍGENOS (ESTUDO)
- Language: Português
- Abstract: ATPDases ou ATP-difosfohidrolases são enzimas que clivam o ATP e o ADP a AMP e Pi e estão envolvidos em inibição da agregação plaquetária. No parasita Schistosoma mansoni nosso grupo identificou e clonou o gene da ATPDase1, e a proteína foi localizada na superfície do tegumento. Recentemente, clonamos o gene da ATPDase2 usando a informação do banco de dados de ESTs de S. mansoni e imunolocalizamos a sua proteína também no tegumento. A TPDase2 foi encontrada em ambas as membranas do tegumento basal e apical juntamente com a ATPDase1, entretanto ATPDase2 somente foi encontrada no espaço sincicial do tegumento. A presença de ambas as enzimas sobre a superfície externa do tegumento sugere um maior papel sobre a regulação de abundância de nucleotídeos. Análise da expressão de ambos os genes foram realizadas por RT-PCR em tempo real usando RNA de ovos, miracídeo, cercária, esquistossômulo e verme adulto. Os resultados mostraram que o gene da ATPDase1 foi mais expresso em ovos (7 vezes), adulto (6 vezes), cercária (3,5 vezes) e esquistossômulo (1,5 vezes) quando comparado ao miracídio, que foi tomado como referência. O gene da ATPDase2 foi mais expresso em ovos (16 vezes), cercária (11 vezes), miracídio (7 vezes) e verme adulto (2 vezes) quando comparado a esquistossômulo, mostrando que ambos os genes são modulados ao longo de seus estágios de ciclo de vida . Para maior caracterização destas enzimas, elas foram expressas heterologamente na levedura Pichiapastoris como proteínas de fusão com cauda de 6 histidinas e as proteínas recombinantes foram purificadas por cromatografia de afinidade com resina de Ni-NTA. As ATPDases recombinantes foram obtidas de forma ativa e medições de atividade enzimática foram realizadas. ATPDase1 mostrou atividades ATPásica e ADPásica em torno de 650 e 160 nmoles Pi.'min POT.'MENOS''mg POT.'MENOS'1' ) respectivamente. ATPDase2 teve atividades ATPásica e ADPásica na faixa de 1050 e 250 nmoles Pi. 'min POT.'MENOS'1'. 'mg POT.'MENOS'1' respectivamente. Adicionalmente, atividades UTPásica e UDPásica também foram encontradas nestas enzimas. Estudos de dicroísmo circular com estas duas enzimas elucidaram suas estruturas secundárias. Com isto, ATPDase1 ('S POT.66' to 'Q POT.507') teve alfa-hélice (7 'POR CENTO'), folha-beta (45 'POR CENTO') e estrutura randômica (48 'POR CENTO'), e a ATPDase2 ('N POT.83' a 'K POT.564') mostrou conter alfa-hélice (14 'POR CENTO'), folha-beta (33 'POR CENTO') e estrutura randômica (53 'POR CENTO'). Nós mostramos que a ATPDase2 é secretada pelo parasita no meio, de forma similar como descrito para as ATP-difosfohidrolases humanas CD39L2 e CD39L4. Adicionalmente, em ensaios de inibição de penetração (cercária em camundongo) usando anticorpo anti-ATPDase1 foi mostrada uma redução em 20 'POR CENTO' da capacidade de penetração através da pele das cercárias previamente incubadas com o anti-soro. Devido a que a expressão do gene da ATPDase2 estava mais alta emmiracídio e cercária, estágios que infectam caramujos e humanos, respectivamente, postulamos que A TPDase2 poderia ajudar no processo de invasão do parasita. No estágio ovo ambos os genes estão altamente expressados sugerindo um possível envolvimento das ATPDases na resposta de proteção contra o sistema imune humano. Ensaios de proteção contra S. mansoni em camundongos, usando as ATPDases 1 e 2 como antígenos, resultaram em uma baixa proteção obtendo-se não mais que 20 'POR CENTO' na redução da carga parasitária
- Imprenta:
- Data da defesa: 19.02.2008
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ABNT
GARCIA, Julio Cesar Levano. Caracterização bioquímica e imunológica das enzimas recombinantes ATP-difosfohidrolases 1 e 2 do parasita Schistosoma mansoni. 2008. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo, São Paulo, 2008. Disponível em: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-31032008-074222/. Acesso em: 03 jun. 2024. -
APA
Garcia, J. C. L. (2008). Caracterização bioquímica e imunológica das enzimas recombinantes ATP-difosfohidrolases 1 e 2 do parasita Schistosoma mansoni (Tese (Doutorado). Universidade de São Paulo, São Paulo. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-31032008-074222/ -
NLM
Garcia JCL. Caracterização bioquímica e imunológica das enzimas recombinantes ATP-difosfohidrolases 1 e 2 do parasita Schistosoma mansoni [Internet]. 2008 ;[citado 2024 jun. 03 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-31032008-074222/ -
Vancouver
Garcia JCL. Caracterização bioquímica e imunológica das enzimas recombinantes ATP-difosfohidrolases 1 e 2 do parasita Schistosoma mansoni [Internet]. 2008 ;[citado 2024 jun. 03 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-31032008-074222/
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