Fisiologia molecular intestinal de Dysdercus peruvianus (Hemiptera) (2008)
- Authors:
- Autor USP: BIFANO, THAÍS DUARTE - IQ
- Unidade: IQ
- Sigla do Departamento: QBQ
- Subjects: BIOQUÍMICA ANIMAL; INSETOS (ESTUDO); HEMIPTERA (ESTUDO); INTESTINO DE ANIMAL (ANÁLISE;ESTUDO)
- Language: Português
- Abstract: A partir da identificação de catepsinas L em ensaios in vitro e em zimogramas partimos para purificação desta enzima no inseto. A região V2 foi selecionada como fonte de obtenção da cisteína proteinase ja que dentre os três ventrículos 0 segundo apresentou maior atividade especifica. Após diversas tentativas de isolar esta proteinase, foi estabelecida uma marcha de purificação que envolvia em todas as etapas a participação de metil metanosulfonato (MMTS), 0 que inativa a proteinase evitando assim autólise ao longo do processo de purificação. A marcha consistiu de três passos cromatográticos (troca-iônica, filtração em gel e afinidade, nesta ordem) onde foi observada a presença de duas cisteína proteinases, cada uma apresentando respectivamente as seguintes massas moleculares 32 e 45 kDa (SOS-PAGE). As duas cisteína proteinases possuem o mesmo pH ótimo igual a 6,3. AIém disso, estas enzimas foram termicamente inativadas a ´40 CELSUN´ segundo uma cinética de primeira ordem aparente, sugerindo a existência de apenas uma espécie molecular de cada enzima na preparação com meia vida de 5 minutos para cis 1 e 4,8 minutos para cis 2. Foi determinada a constante de dissociação entre enzima-inibidor, onde foi observado os valores de 17,3 ´NANOMOL´ para cis 1 e 7,11 ´NANOMOL´ para cis 2 atraves da titulação por E-64. A eficiência de catalise cis 1 e cis 2 é maior para 0 substrato sintético Z-FR-MCA do que para Z-RR-MCA, indicando que tratava-se de catepsinas L. Com 0intuito de descrever os mecanismos moleculares por trás dos fenômenos fisiológicos no intestino médio do Hemiptera Dysdercus peruvianus foi construida uma biblioteca de cDNA a partir de mRNA deste tecido. Utilizamos ESTs provenientes desta biblioteca com 0 objetivo de identificar genes transcritos relacionados com proteinas de transporte de glicose alem de enzimas digestivas. Após 0 processamento das leituras, surgiram 1053 ESTs úteis. Montando estes ESTs ) alinhamento de bases, foram produzidos 62 contíguos e 841 singletos, 0 que totaliza 903 sequências únicas. Entre as sequencias homólogas encontradas as mais relevantes para 0 nosso estudo foram: ´BETA`-glicosidase (marcadora de membranas microvilares), ÁLFA´-glicosidase (marcadora de membranas perimicrovilares), aminopeptidase (espaço perimicrovilar), catepsina L (conteúdo de vesículas secretoras) e proteina transportadora de açúcar do tipo GLUT. Estas sequências encontradas tiveram a sua transcrição especifica (ou preferencial) averiguada por RT-PCR semiquantitativo nos diferentes tecidos do inseto estudado (intestino medio, tubulo de Malpighi, corpo gorduroso, glandula salivar, ventriculo 1, ventriculo 2 e ventriculo 3 do intestino médio). O transporte de glicose e agua in vivo foi estudado. Para isso, os insetos foram alimentados com uma solução contendo glicose e corante nao absorvível seguido de dissecação e análise do conteúdo luminal. 0 transporte de agua e glicose foi inibido por floretina 0,2´MILIMOL´ (inibidor do uniportador GLUT) e por florizina 0,1 ´MILIMOL´ (inibidor do simportador SGL T) e ativado por ´K INDi.2 S0. INDi.4 50 ´MILIMOL´. Isto sugere a presença do transportador do tipo uniportador (GLUT), e do simportador ´K POT.+ -glicose (SGLT), ambos co-transportando agua. 0 transcriptoma revelou proteina homóloga a transportador GLUT cuja sequência está parcialmente completa e foi analisada com ferramentas de bioinformática
- Imprenta:
- Data da defesa: 10.10.2008
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ABNT
BIFANO, Thaís Duarte. Fisiologia molecular intestinal de Dysdercus peruvianus (Hemiptera). 2008. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo, São Paulo, 2008. Disponível em: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-27112008-093426/. Acesso em: 03 jun. 2024. -
APA
Bifano, T. D. (2008). Fisiologia molecular intestinal de Dysdercus peruvianus (Hemiptera) (Tese (Doutorado). Universidade de São Paulo, São Paulo. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-27112008-093426/ -
NLM
Bifano TD. Fisiologia molecular intestinal de Dysdercus peruvianus (Hemiptera) [Internet]. 2008 ;[citado 2024 jun. 03 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-27112008-093426/ -
Vancouver
Bifano TD. Fisiologia molecular intestinal de Dysdercus peruvianus (Hemiptera) [Internet]. 2008 ;[citado 2024 jun. 03 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-27112008-093426/
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