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Tese

Processos osmorregulatórios no caranguejo Dilocarcinus pagei (Decapoda, Trichodactylidae), um antigo invasor da água doce: estudo das atividades (Na,K)-ATPase e V-ATPase branquias (2009)

  • Authors:
  • Autor USP: FIRMINO, KELLY CRISTINA SILVA - FFCLRP
  • Unidade: FFCLRP
  • Sigla do Departamento: 593
  • Subjects: CARANGUEJO; CRUSTACEA; CINÉTICA; ENZIMAS; BIOQUÍMICA
  • Language: Português
  • Abstract: Os crustáceos são originariamente marinhos; ao longo da evolução, diversas espécies invadiram ambientes de salinidades menores, chegando à água doce. A capacidade dos crustáceos colonizarem com sucesso o ambiente dulcícola depende do desenvolvimento de mecanismos eficientes de hiperosmorregulação. A osmolalidade e a composição iônica da hemolinfa de um crustáceo, em meios diluídos, refletem o equilíbrio dinâmico entre a perda de íons por difusão e pela urina e sua reabsorção do meio externo, através das brânquias. A (Na,K)-ATPase branquial desempenha um papel chave no processo de captura de 'Na POT. +' a partir de ambientes diluídos e suas características cinéticas vem sendo investigadas recentemente, embora as enzimas de caranguejos dulcícolas sejam pouco conhecidas. Segundo o modelo atual, a afinidade por 'Na POT +' é o parâmetro cinético mais variável entre as enzimas de diferentes espécies, refletindo a salinidade do habitat do animal, de modo que enzimas de espécies bem adaptadas à água doce apresentam afinidades maiores por 'Na POT.+'. Entretanto, vários resultados conflitantes têm sido relatados nos últimos anos. Recentemente, foi proposto que uma V-ATPase também desempenha papel essencial na captação de 'Na POT. +' através das brânquias dos crustáceos dulcícolas. Esta enzima ainda é praticamente desconhecida: suas características cinéticas não foram estudadas e a relação entre a magnitude da sua atividade e a salinidade do meio externo não estáestabelecida. Este projeto teve por objetivo a caracterização das enzimas (Na,K)-ATPase e V-A TPase das brânquias posteriores do caranguejo hololimnético Dilocarcinus pagei, considerado um antigo invasor da água doce. A (Na,K)-ATPase foi caracterizada em animais mantidos em água doce, a fim de comparar suas propriedades cinéticas com aquelas das enzimas de outras espécies de caranguejos, habitantes de meios mais salinos, visando melhorar o entendimento das adaptações bioquímicas associadas à invasão da água doce. A V-ATPase foi caracterizada em animais mantidos em água doce ou expostos por diferentes intervalos de tempo à salinidade de 21%0 ou ainda aclimatados por 10 dias a diferentes salinidades (5- 21 %o), visando estabelecer uma relação entre a magnitude da atividade e a salinidade do meio, além de investigar os mecanismos de regulação da atividade da enzima. A análise da nação microsomal branquial de D. pagei mantido em água doce em gradiente contínuo de sacarose mostrou dois picos protéicos (25-35% e 35-45% de sacarose), ambos com atividades 'K POT. +'-fosfatase, (Na,K)-ATPase e V-ATPase. Estes resultados indicam a presença de frações de membrana com densidades distintas, apresentando, em ambos os casos, as principais bombas de íons envolvidas na captação de 'Na POT. +'. Estas membranas podem ser originárias de locais distintos do epitélio branquial posterior assimétrico deste caranguejo. A análise por Western blotting revelou duasbandas imunoespecíficas (Mr 116 kDa e 105 kDa) correspondentes à subunidade a. da (Na,K)-A TPase, sugerindo a presença de duas isoformas nas brânquias posteriores do animal. A estimulação da atividade 'K POT. +' fosfatase da (Na,K)-ATPase pelo PNFF envolveu interações sítio-sítio ('n IND.H'= 1,4), com V= 43,4 '+ OU -' 2,2 U 'mg POT.-l' e 'K IND.0,5'= 1,13 '+ OU -' 0,06 mmol 'L POT.-1'. A estimulação da atividade da enzima por 'K POT. +' (V= 39,9 '+ OU -' 1,9 U 'mg POT.-1' e 'K IND.0,5'= 4,2 '+ OU -' 0,2 mmol 'L POT.-1'), 'Mg POT.2+'(V= 45,O '+ OU -' 2,2 U 'mg POT.-1', 'K IND.0,5'= 0,82 '+ OU -' 0,04 mmol 'L POT.-1') e 'NH IND.4 POT.+'(V= 31,7 '+ OU -' 1,6 U 'mg POT.-1', 'K IND.0,5'= 19,0 '+ OU -' 0,9 mmol 'L POT.-1') também ocorreu por meio de interações sítio-sítio. A afInidade aparente da enzima pelo PNFF e 'Mg POT.2+' foi similar às relatadas para enzimas de outros crustáceos, incluindo caranguejos habitantes de meios mais salinos. Entretanto, a enzima de D. pagei apresentou menor afinidade aparente por íons 'K POT.+' que as outras espécies já estudadas. A atividade 'K POT.+'-fosfatase da (Na,K)-ATPase branquial de D. pagei mantido em água doce foi estimulada sinergicamente por 'K POT.+' e 'NH IND.4 POT.+' sugerindo a presença de dois sítios de ligação para estes íons na molécula da enzima. Ouabaína (4 mmol 'L POT.-1') inibiu a atividade PNFFase total da preparação ( 89%), por meio de uma curva monofásica ('K IND.1= 225,6, '+ OU -' 11,3'MU' moI 'L POT.-1'), sugerindo que, se presentes na fração microsomal, as duas isoenzimas da (Na,K)-ATPase apresentam sensibilidades próximas para o inibidor. Ortovanadato (1 'MU'mol 'L POT.-1') inibiu 95% da atividade PNFFase total por meio de uma curva bifásica, reforçando a sugestão da presença de duas isoenzimas na preparação. A hidrólise do ATP pela (Na,K)-ATPase branquial de D. pagei mantido em água doce ocorreu em sítios de alta (V= 6,4 '+ OU -' 0,32 U 'mg POT.-l' e 'K IND.0,5' = 0,34 '+ OU -' 0,02 'MU'mol 'L POT.-1') e baixa afinidade (V= 127,1 '+ OU -' 6,2 U 'mg POT.-1e 'K IND.M' = 84 '+ OU - 4,1 'MU'mol 'L POT.-1'). Não foi encontrada uma correlação direta entre a afinidade pelo ATP e o habitat de diferentes espécies de caranguejos. A atividade (Na,K)-ATPase específica de D. pagei mantido em água doce foi cerca de 3 vezes menor que relatada para Potamon edulis, única espécie de caranguejo dulcícola para a qual este parâmetro foi relatado. Atividades específicas muito maiores foram encontradas para caranguejos estuarinos, particularmente quando aclimatados a salinidades baixas. A baixa atividade específica determinada para D. pagei pode ser atribuída ao baixo gradiente osmoiônico que este animal mantém entre a hemolinfa e o meio externo, comparado a outros caranguejos dulcícolas, que o caracteriza como uma espécie particularmente bem adaptada ao ambiente dulcícola. A estimulação da atividade da enzima por íons 'Na POT.+'(V =133,8 '+ OU -' 7,3 U 'mg POT-1'e 'K IND. 0,5'= 4,7 '+ OU -' 0,3 mmol 'L POT.-1'), 'Mg POT.2+'(V= 136,5 '+ OU -' 8,0 U 'mg POT.-1', 'K IND.0,5'= 0,62 '+ OU -' 0,04 mmol 'L POT.-1'), 'K POT.+'(V = 131,7 '+ OU -' 7,9 U 'mg POT.-1' e 'K IND.0,5'= 0,47:J '+ OU -' 0,03 mmol 'L POT.-1') e NH IND.4 POT.+'(V= 125,6 '+ OU -'6,3 U 'mg POT.-1', 'K IND.0,5'= 1,90 '+ OU -'0,09 mmol L POT.-1) ocorreu por meio de interações sítio-sítio. A afInidade aparente por 'Na POT.+' da enzima de D. pagei é baixa, se comparada às relatadas para outros animais dulcícolas, e similar às encontradas para espécies estuarino/marinhas. Em contraste, a afinidade aparente por 'K POT.+' é 2,5 a 5 vezes maior que as determinadas para espécies habitantes de meios mais salinos e aparentemente está mais relacionada ao habitat do animal que a afinidade por 'Na POT.+'. Esta possibilidade é coerente com o fato da (Na,K)-ATPase branquial dos crustáceos apresentar os sítios de ligação de 'K POT.+' expostos para a hemolinfa, o que possibilita a modulação da atividade da enzima pela concentração de 'K POT.+' na hemolinfa. Ao contrário do observado para várias outras espécies de caranguejos, a atividade (Na,K)-ATPase branquial de D. pagei não foi estimulada sinergisticamente por 'K POT.+' e NH IND.4 POT.+'. Entretanto, a presença de um dos íons no meio reacional provoca o aumento da afinidade aparente da enzima pelo outro em cerca de 3 vezes. Fisiologicamente, esta característica cinética pode serimportante para garantir o transporte de ambos os íons pela enzima, mesmo em presença de concentrações relativamente elevadas do outro. Ouabaína (3 mmol 'L POT.-1') inibiu a atividade ATPase total ('APROXIMADAMENTE IGUAL A' 78%) por meio de uma curva bifásica ('K IND.I'= 6,21 '+ OU -' 0,32 'mu'mol 'L POT.-1' e 101,2 '+ OU -' 5,1 'MU'mol 'L POT.-1'), reforçando os resultados anteriores no sentido de demonstrar a existência de duas isoenzimas da (Na,K)-ATPase nas brânquias posteriores de D. pagei. Observou-se também uma inibição bifásica por ortovanadato (10 'MU'mol 'L pot.-1'), que inibiu a atividade ATPase total em 85%. O pH ótimo para a atividade V-ATPase branquial de D. pagei foi de 7,5. A modulação da atividade V-ATPase do animal mantido em água doce por ATP (V= 26,5 '+ ou -'1,3 U 'mg POT.-1'; 'K IND.0,5'= 3,9 '+ OU -' 0,2 mmol 'L POT.-1') e 'Mg POT.2+' (V = 27,9 '+ OU -' 1,4 U 'mg POT.-1'; 'K IND.0,5' =0,80 '+ OU -' 0,04 mmol 'L POT.-1') ocorreu por meio de interações cooperativas. Já a inibição da atividade ATPase insensível ao ortovanadato por bafilomicina 'A IND.1' ocorreu segundo uma curva monofásica (K IND.I'= 55,0 '+ OU -' 2,8 nmol 'L POT.-1'). Cerca de 44 % da atividade ATPase total foi inibida, correspondendo à V-ATPase. A atividade V-ATPase branquial de D. pagei diminuiu acentuadamente em resposta à exposição à salinidade de 21 %o. Após 1 h de exposição, a atividade diminuiu cerca de 3 vezes, chegando a 4 vezes após 24h, o queindica a atuação de mecanismos eficientes de regulação a curto prazo. Curiosamente, a atividade V-ATPase foi cerca de 2 vezes maior para um tempo de aclimatação de 120h a 21 %, comparado a 24 h, embora 2 vezes menor que a estimada em água doce. Passadas 240 h, a atividade voltou aos baixos níveis observados entre lh e 24h, o que indica a ação de mecanismos de regulação a longo prazo. Além da diminuição da atividade específica também foi observado aumento da afinidade da enzima por ATP (12 vezes) e 'Mg POT.2+' (3 vezes) em resposta à exposição dos animais a 21 %. Similarmente, ocorreu um aumento de até 190 vezes na afinidade da enzima por bafilomicina 'A IND.1'. Propõe-se que, em resposta à alteração de salinidade, ocorrem mudanças conformacionais tanto em 'V IND.1' (onde se encontram os sítios de ligação de ATP e 'Mg POT.2+') quanto 'V IND.0' (onde se localiza o sítio de ligação de bafilomicina), resultando numa maior exposição do sítio para o inibidor e no aumento da afinidade por 'Mg POT.2+' e ATP. Como os aumentos de afinidade são observados já após lh de exposição, este mecanismo parece ser independente da expressão protéica e, portanto, não estaria relacionado à expressão de isoformas diferentes de alguma das subunidades da enzima. A diminuição da atividade V-ATPase branquial de D. pagei em resposta à exposição a uma salinidade elevada é compatível com os mecanismos propostos para a atuação desta enzima no processo de capturaativa de 'Na POT.+' em crustáceos dulcícolas. Após 10 dias de aclimatação ainda se tem atividade V-ATPase detectável nas frações microsomais das brânquias posteriores do animal, possivelmente envolvida nas funções de regulação ácido-base e excreção de amônia. Os resultados obtidos para a aclimatação de D. pagei por um período de 10 dias a salinidades entre 5 e 21 %o mostraram também uma diminuição acentuada da atividade V-A TPase em resposta ao aumento da salinidade. Entretanto, com exceção da salinidade mais baixa (5%) não se observou aumento da afinidade da enzima por bafilomicina, sugerindo que esta alteração seja limitada a tempos de aclimatação mais curtos. Entretanto, também se verificou um aumento acentuado da afinidade da enzima por ATP e 'Mg POT.2+'
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 03.06.2009
    • Acesso à fonte
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    • ABNT

      FIRMINO, Kelly Cristina Silva. Processos osmorregulatórios no caranguejo Dilocarcinus pagei (Decapoda, Trichodactylidae), um antigo invasor da água doce: estudo das atividades (Na,K)-ATPase e V-ATPase branquias. 2009. Dissertação (Mestrado) – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2009. Disponível em: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/59/59138/tde-19082009-112806/. Acesso em: 03 jun. 2024.

    • APA

      Firmino, K. C. S. (2009). Processos osmorregulatórios no caranguejo Dilocarcinus pagei (Decapoda, Trichodactylidae), um antigo invasor da água doce: estudo das atividades (Na,K)-ATPase e V-ATPase branquias (Dissertação (Mestrado). Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/59/59138/tde-19082009-112806/

    • NLM

      Firmino KCS. Processos osmorregulatórios no caranguejo Dilocarcinus pagei (Decapoda, Trichodactylidae), um antigo invasor da água doce: estudo das atividades (Na,K)-ATPase e V-ATPase branquias [Internet]. 2009 ;[citado 2024 jun. 03 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/59/59138/tde-19082009-112806/

    • Vancouver

      Firmino KCS. Processos osmorregulatórios no caranguejo Dilocarcinus pagei (Decapoda, Trichodactylidae), um antigo invasor da água doce: estudo das atividades (Na,K)-ATPase e V-ATPase branquias [Internet]. 2009 ;[citado 2024 jun. 03 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/59/59138/tde-19082009-112806/

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