Expressão e purificação das Triptofanil tRNA Sintetase de Leishmania major (2010)
- Authors:
- Autor USP: FERNANDES, ANDRÉ LUIZ VIEIRA ZORZETTO - FMRP
- Unidade: FMRP
- Sigla do Departamento: RBP
- Subjects: LEISHMANIOSE CUTÂNEA; VIRULÊNCIA; EXPRESSÃO GÊNICA
- Language: Português
- Abstract: As Aminoacil tRNA Sintetase (aaTRS) catalisam a aminoacilação de aminoácidos e a ligação subsequente deste aminoacil ácido a seu respectivo tRNA. Em humanos, além do seu papel na ativação do aminoácido, a Triptofanil tRNA Sintetase (TrpTRS) foi caracterizada como um inibidor da angiogênese após sofrer proteólise por elastase de leucócito. O genoma de Leishmania major codifica duas TrpTRSs diferentes, uma forma mitocondrial (TrpTRS1) e uma forma citosólica (TrpTRS2). Os genes das TrpTRS1 e 2 foram amplificados a partir de DNA genômico de LV39 e clonados no vetor pET28a. As proteínas foram expressas como corpo de inclusão em Rosetta (DE3) após indução com 0,5mM de IPTG por 4 horas à 37°C. Esses corpos de inclusão se mostraram passíveis de solubilização por 8M uréia ou 1,5% sarcosil, e, após purificação por lavagem do corpo de inclusão foi possível obter as proteínas puras com atividade de aminoacilação e estrutura secundária quando estas eram solubilizadas com detergente. O uso de cromatografia de afinidade em Ni-Sepharose só foi possível após solubilização por uréia. Foram geradas linhagens de L. major com expressão aumentada para os genes TrpTRS1 e TrpTRS2 assim como uma linhagem heterozigota para TrpTRS2. Essas linhagens foram utilizadas em ensaios de infecção in vivo, no qual foi possível observar um papel das TrpTRSs na formação de lesão. Essas proteínas heterólogas também foram utilizadas na geração de anticorpos policlonais que permitiram confirmar a localização mitocondrial de TrpTRSl. Por experimento de Westem blot foi possível caracterizar um possível processamento sofrido por TrpTRS2 envolvendo a perda da extremidade N-terminal
- Imprenta:
- Publisher place: Ribeirão Preto
- Date published: 2010
- Data da defesa: 14.01.2010
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ABNT
FERNANDES, André Luiz Vieira Zorzetto. Expressão e purificação das Triptofanil tRNA Sintetase de Leishmania major. 2010. Dissertação (Mestrado) – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2010. . Acesso em: 12 jun. 2024. -
APA
Fernandes, A. L. V. Z. (2010). Expressão e purificação das Triptofanil tRNA Sintetase de Leishmania major (Dissertação (Mestrado). Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. -
NLM
Fernandes ALVZ. Expressão e purificação das Triptofanil tRNA Sintetase de Leishmania major. 2010 ;[citado 2024 jun. 12 ] -
Vancouver
Fernandes ALVZ. Expressão e purificação das Triptofanil tRNA Sintetase de Leishmania major. 2010 ;[citado 2024 jun. 12 ]
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