Produção, purificação e caracterização bioquímica de urna ‘beta’-glucosidase produzida pelo fungo termófilo Rhizomucor miehei em meio semi-sólido (2011)
- Authors:
- Autor USP: SOUZA, ANDRESA LUPERI NICÁCIO DE - FFCLRP
- Unidade: FFCLRP
- Sigla do Departamento: 593
- Subjects: ENZIMAS CELULOLÍTICAS (ISOLAMENTO E PURIFICAÇÃO;PRODUÇÃO;CARACTERÍSTICAS); FUNGOS TERMÓFILOS; MUCORALES; BIOENERGÉTICA; BIOQUÍMICA
- Language: Português
- Abstract: Atualmente é grande o interesse na degradação enzimática da celulose visando o processamento de resíduos lignocelulósicos para a geração de bioenergia e produtos químicos em geral, especialmente etanol, com baixo impacto ambiental. A celulose é o recurso biológico renovável mais abundante na natureza, consistindo de um homopolissacarídeo linear de unidades de D-glicose unidas por ligações glicosídicas ‘beta’-1,4. O conjunto de enzimas envolvidas na degradação da celulose ("complexo celulolítico") reúne endo-1,4-‘beta’-glucanases, exo-1,4-‘beta’-glucanases e 1,4-‘beta’-glucosidases. As duas primeiras classes de enzimas hidrolisam ligações internas das moléculas de celulose, liberando oligossacarídeos e celobiose, hidrolisados a glicose pelas ‘beta’-glucosidases. Usualmente, endo- e exo-glucanases são fortemente inibidas por celobiose e celo-oligossacarídeos curtos e a maioria das ‘beta’-glucosidases conhecidas também é inibida por glicose. Uma alternativa para diminuir os efeitos deletérios da inibição pelo produto na sacarificação da celulose e aumentar a eficiência do processo é o uso de excesso de enzimas, em especial ‘beta’-glucosidase. Entretanto, esta possibilidade tem sido limitada pelo alto custo da produção de enzimas, o que tem levado a uma busca crescente por microorganismos bons produtores de ‘beta’-glucosidases capazes de crescer em substratos baratos e abundantes. O fungo termófilo Rhizomucor miehei produziu altos níveis de, ‘beta’-glucosidase (74,2 ‘+ OU –’ 8,9 U/g) quando cultivado por dois dias a 40°C em meio semi-sólido constituído de farelo de trigo e água deionizada (1:1,5, m:v), suplementado com casca de arroz (1,4%). A enzima foi purificada por filtração em gel de Sephadex G-75, seguida por cromatografia em DMAE fractogel, concentração por ultrafiltração (corte de 10 kDa) e cromatografia em Fenil Sepharose. Após a purificação,a ‘beta’-glucosidase atingiu uma atividade específica de 1350,0 ‘+ OU –’148,5 U/mg com um rendimento de 20,9 % e fator de purificação de 60,3 vezes. A pureza da enzima foi confirmada por PAGE, SDS-PAGE e focalização isoelétrica. A enzima purificada apresentou teor de carboidratos totais de 63,6 % e massa molecular aparente de 42 kDa, estimada por filtração em gel, e 125,2 kDa por SDS-PAGE. A temperatura ótima de reação foi de 70°C e o pH ótimo foi 5,0. A enzima foi estável quando incubada em água por 60 min a 65°C, com tempo de meia-vida de 15 min a 70°C. A enzima purificada hidrolisou p-nitrofenil-‘beta’-D-glucopiranosídeo e celobiose com velocidades máximas de 1378,0 ‘+ OU –’ 179,1 e 272,0 ‘+ OU –’ 27,2 U/mg, respectivamente, porém, a afinidade aparente da enzima foi cerca de 7 vezes maior para o substrato sintético, resultando numa eficiência catalítica (‘V IND. M’/‘K IND. 0,5’ = 7413,4 U ‘mg POT. -1’ ‘mmol POT. -1’ L) 35,7 vezes maior que aquela determinada para a hidrólise da celobiose (‘V IND. M’/‘K IND. 0,5’ = 207,6 U ‘mg POT. –l’ ‘mmol POT. -1’ L). L-Arabinose, sacarose, frutose, xilose e galactose em concentração 50 mmol ‘L POT. –l’ não inibiram a hidrólise de pNP-Glu. Em contraste, a atividade foi inibida em 75% por glicose 50 mmol ‘L POT. -1’ O extrato bruto do cultivo de R. miehei apresentou forte ação sinérgica com o extrato bruto do cultivo de T. reesei, rico em celulases, na hidrólise de papel de filtro, atingindo um máximo de açúcares redutores totais e glicose após 120 h de tratamento. A alta produção, num meio simples e barato em tempo de cultivo curto, bem como a alta temperatura de reação da enzima, boa estabilidade térmica, baixa sensibilidade à presença de diferentes mono- e dissacarídeos no meio reacional, ação sinérgica com celulares, na forma bruta, para a hidrólise de celulose, além de uma altaeficiência catalítica sugerem que a ‘beta’-glucosidase de R. miehei tem potencial para aplicação industrial na hidrólise de materiais celulósicos
- Imprenta:
- Publisher place: Ribeirão Preto
- Date published: 2011
- Data da defesa: 06.09.2011
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ABNT
SOUZA, Andresa Luperi Nicácio de. Produção, purificação e caracterização bioquímica de urna ‘beta’-glucosidase produzida pelo fungo termófilo Rhizomucor miehei em meio semi-sólido. 2011. Dissertação (Mestrado) – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2011. . Acesso em: 26 abr. 2024. -
APA
Souza, A. L. N. de. (2011). Produção, purificação e caracterização bioquímica de urna ‘beta’-glucosidase produzida pelo fungo termófilo Rhizomucor miehei em meio semi-sólido (Dissertação (Mestrado). Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. -
NLM
Souza ALN de. Produção, purificação e caracterização bioquímica de urna ‘beta’-glucosidase produzida pelo fungo termófilo Rhizomucor miehei em meio semi-sólido. 2011 ;[citado 2024 abr. 26 ] -
Vancouver
Souza ALN de. Produção, purificação e caracterização bioquímica de urna ‘beta’-glucosidase produzida pelo fungo termófilo Rhizomucor miehei em meio semi-sólido. 2011 ;[citado 2024 abr. 26 ]
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