Hialuronildase testicular bovina: comportamento em interfaces líquido/AR, imobilização em filmes Langmuir-Blodgett e atividade enzimática (2011)
- Authors:
- Autor USP: MONTEIRO, DOUGLAS SANTOS - FFCLRP
- Unidade: FFCLRP
- Sigla do Departamento: 593
- Subjects: ENZIMAS (ATIVIDADE); IMOBILIZAÇÃO; ADSORÇÃO; REOLOGIA (PROPRIEDADES)
- Language: Português
- Abstract: A hialuronidase (HAase) é uma enzima que catalisa a hidrólise do ácido hialurônico (HA), o maior componente da matriz extra-celular. Nos seres vivos, por meio de sua função catalítica, ela participa de importantes mecanismos, como difusão de venenos, fertilização, sinalização celular, além de atuar em alguns tipos de câncer e metástase. Nesta tese, utilizou-se a hialuronidase testicular bovina (BT-HAase) para melhor compreender as propriedades interfaciais da proteína, bem como sua interação com sistemas modelos de membrana biológica e caracterização espectroscópica na interface água-ar e monocamada lipídica-ar. Estudaram-se as propriedades interfaciais de monocamadas de Gibbs de BT-HAase, acompanhando-se a cinética de adsorção na interface líquido-ar, por meio de variações na pressão superficial (‘pi’), e as propriedades reológicas superficiais dilatacionais, por meio do método de oscilação da gota pendente. As curvas de cinética de adsorção mostraram que os produtos das concentrações da proteína ao quadrado pelo tempo de indução fornecem um valor constante de 3.9 ‘+ OU –’ 0,4 (‘mu’g ‘mL POT. -1)2’ s, denotando um mecanismo predominantemente difusivo. Empregando-se um modelo termodinâmico que trata a monocamada como uma solução bidimensional, determinaram-se parâmetros relacionados à adsorção da proteína (área parcial molar, ‘ômega’, e densidade superficial, ‘gama’), assim como a equação de estado (‘pi’= f(‘ômega’, ‘gama’). e a isoterma de adsorção c= f(‘ômega’, ‘gama’, b), na qual b representa a constante de equilíbrio de adsorção. O valor obtido para a razão ‘ômega IND. max’/‘ômega IND. min’ de 2,55, é típico de proteínas globulares. Além disso, foram estudadas as propriedades reológicas da monocamada em função da frequência (f) de deformação da área superficial, para 5,0 mHz <f < 0,5 Hz e O < ‘pi’< 30 mN ‘m POT. -1’. Foi observado que, à medida que f aumenta, a viscosidade superficial, ‘n IND. d’, diminui, e a elasticidade, ‘E IND. d’, aumenta. A monocamada se mostrou elástica em frequências maiores que 0,115 Hz, o que corresponde a um tempo de relaxação de ~8 s, valor típico para proteínas. Para a maior frequência utilizada, o valor de ‘E IND. d’ é pequeno em pressões baixas, atinge um máximo de 55 mN ‘m POT. -1’ em ‘pi’ ~20 mN ‘m POT. -1’, e cai para ~24 mN ‘m POT. –l’ em ‘pi’ ~ 30 mN ‘m POT. –l’. Os estudos de adsorção da proteína em monocamadas de Langmuir lipídicas de dipalmitoil-fosfatidilcolina, DPPC, galactocerebrosídeo, GalCer, e sal de sódio do ácido dihexadecilfosfórico em subfase de ‘Zn POT. 2+’, ‘DHP/Zn POT. 2+’, indicaram que a pressão de exclusão, ‘pi IND. exc’ segue a ordem: ‘DHP/Zn POT. 2+’ > Galcer~DPPC. Para imobilização de BT-HAase em filmes LB, foram construídos filmes do tipo Y de três camadas de DHP mediadas por ‘Zn POT. 2+’, terminados com as caudas hidrofóbicas. A deposição conjunta de uma monocamada mista de DPPC e BT-HAase sobre o filme de DHP foi possível por meio da injeção da proteína na subfase, seguida de sua adsorção na interface, e inserção do substrato em ‘pi’ = 30 mN ‘m POT. -1’. A massa de BT-HAase incorporada aos filmes foi de 369 ‘+ OU –’ 28 ng. A atividade catalítica da enzima imobilizada foi 22 vezes maior que aquela da enzima livre em solução. Este aumento de atividade foi atribuído à estabilização da proteína no filme lipídico, fácil acesso do substrato ao sítio catalítico e adsorção preferencial da forma pura da BT-HAase em detrimento de proteínas de menor massa molecular presentes na amostra comercial. Este sistema poderá ser útil na construção de um biosensor fluorímetrico para diagnóstico de cânceres do trato gênito-urinário. A análise de algumaspropriedades interfaciais da proteína purificada, BT-HAase-p, mostrou que a mesma corresponde à fração mais ativa superficialmente e é a forma predominante na adsorção em equilíbrio. Experimentos de espectroscopia de absorção/reflexão na região do infravermelho com modulação da polarização (PM-IRRAS) de monocamadas da BT-HAase-p superem que a enzima adquire uma orientação preferencial na interface ar/água e ar/monocamada de DPPC, indicando a existência de estruturas ‘alfa’-hélice como predominante. Desta forma, o sítio catalítico, oposto as regiões mais hidrofóbicas, deve estar voltado para a subfase aquosa. Os resultados das análises espectroscópicas corroboram um dos motivos apresentados para a elevada capacidade catalítica para a BT-HAase imobilizada nos filmes LB
- Imprenta:
- Publisher place: Ribeirão Preto
- Date published: 2011
- Data da defesa: 31.08.2011
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ABNT
MONTEIRO, Douglas Santos. Hialuronildase testicular bovina: comportamento em interfaces líquido/AR, imobilização em filmes Langmuir-Blodgett e atividade enzimática. 2011. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2011. . Acesso em: 23 abr. 2024. -
APA
Monteiro, D. S. (2011). Hialuronildase testicular bovina: comportamento em interfaces líquido/AR, imobilização em filmes Langmuir-Blodgett e atividade enzimática (Tese (Doutorado). Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. -
NLM
Monteiro DS. Hialuronildase testicular bovina: comportamento em interfaces líquido/AR, imobilização em filmes Langmuir-Blodgett e atividade enzimática. 2011 ;[citado 2024 abr. 23 ] -
Vancouver
Monteiro DS. Hialuronildase testicular bovina: comportamento em interfaces líquido/AR, imobilização em filmes Langmuir-Blodgett e atividade enzimática. 2011 ;[citado 2024 abr. 23 ]
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