Geração de células de pluripotência induzida (iPS) humanas utilizando vetores lentivirais e determinação do perfil de integração lentiviral (2012)
- Authors:
- Autor USP: REIS, LUIZA CUNHA JUNQUEIRA - FCFRP
- Unidade: FCFRP
- Sigla do Departamento: S/D
- Subjects: CÉLULAS-TRONCO; LENTIVIRUS; GENES
- Keywords: Células-tronco de pluripotância induzida; integração lentiviral; iPS cells; lentiviral integration; lentiviral vectors; LM-PCR; LM-PCR; vetores lentivirais
- Language: Português
- Abstract: As células iPS surgiram com a promessa de contornar as limitações das células-tronco embrionárias, como questões éticas, segurança, compatibilidade e disponibilidade. Essas células podem ser obtidas a partir de células somáticas de indivíduos normais ou de pacientes com doenças genéticas, fazendo destas uma importante ferramenta para o screening de drogas, modelos de doenças e testes toxicológicos. Grandes avanços ocorreram na reprogramação de células diferenciadas pela expressão forçada de fatores de transcrição (FT), principalmente, através de vetores lentivirais (VL), que proporcionam uma reprogramação eficiente. Entretanto, a inserção lentiviral no genoma humano e sua influência na reprogramação é pouco conhecida. Neste trabalho, avaliamos o perfil de inserção dos VL utilizados na geração de iPS. As iPS foram geradas e caracterizadas por nosso grupo a partir de fibroblastos humanos transduzidos com VL contendo 3 FT [SOX2, TCL-1A e C-MYC (célula TSM)], e de células mesenquimais derivadas de tecido adiposo com um vetor lentiviral policistrônico contendo 4 FT [OCT4, SOX2, KLF4 e C-MYC (iPS 4FT)]. Cinco colônias isoladas de cada iPS foram mapeadas e analisadas quanto aos sítios de inserção pela técnica de LM-PCR. O DNA genômico digerido foi amplificado com um primer específico para o LTR viral e outro para um linker sintético. Os produtos foram clonados, sequenciados, e analisados em bancos de dados para identificar similaridades com o genoma humano, entre outras análises. Na célula TSM, 176 sequências, obtidas com a técnica de LM-PCR, apresentaram identidade com o genoma humano, sendo que cerca de 50% ocorreram em regiões gênicas com 94% destas em introns. Já nas iPS 4FT, 251 sequências apresentaram identidade, com cerca de 45% atingindo genes, 92% destas em introns. As inserções distribuíram-se por todos os cromossomos,com preferência pelos cromossomos 16, 17 e 20 para a TSM e pelos cromossomos 11, 15 e 17 para a iPS 4FT. Analisamos a distância da inserção ao sítio de início de transcrição (TSS), e inserções próximas a ilhas CpG, que em geral correspondem a regiões regulatórias. A maior proporção de inserção ocorreu a partir de ±30Kb de distância desses sítios. Os sítios frágeis e as regiões repetitivas do genoma foram atingidas, mas com uma frequência baixa. Os resultados mostraram uma preferência de inserção lentiviral por regiões gênicas nas iPS, indicando a possível participação de proteínas como LEDGF/p75 na integração nas células estudadas. Este trabalho mostrou que o local da integração pode contribuir para a reprogramação e, apesar de possíveis efeitos negativos das integrações, estas as células iPS ainda são uma ferramenta importante para estudos in vitro. E identificar fatores que influenciem a seleção do sítio de inserção é importante para determinar regiões cromossômicas \"seguras\" para a integração, aumentando a segurança no uso clínico
- Imprenta:
- Publisher place: Ribeirão Preto
- Date published: 2012
- Data da defesa: 28.11.2012
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ABNT
REIS, Luiza Cunha Junqueira. Geração de células de pluripotência induzida (iPS) humanas utilizando vetores lentivirais e determinação do perfil de integração lentiviral. 2012. Dissertação (Mestrado) – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2012. Disponível em: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60135/tde-26022013-092913/. Acesso em: 01 maio 2024. -
APA
Reis, L. C. J. (2012). Geração de células de pluripotência induzida (iPS) humanas utilizando vetores lentivirais e determinação do perfil de integração lentiviral (Dissertação (Mestrado). Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60135/tde-26022013-092913/ -
NLM
Reis LCJ. Geração de células de pluripotência induzida (iPS) humanas utilizando vetores lentivirais e determinação do perfil de integração lentiviral [Internet]. 2012 ;[citado 2024 maio 01 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60135/tde-26022013-092913/ -
Vancouver
Reis LCJ. Geração de células de pluripotência induzida (iPS) humanas utilizando vetores lentivirais e determinação do perfil de integração lentiviral [Internet]. 2012 ;[citado 2024 maio 01 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60135/tde-26022013-092913/
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