Produção de peptidase e lipase nativas por Fusarium oxysporum e obtenção de uma quimera recombinante de peptidase e lipase expressa em Pichia pastoris (2017)
- Authors:
- Autor USP: SIQUEIRA, ANA CLAUDIA RODRIGUES DE - FCFRP
- Unidade: FCFRP
- Sigla do Departamento: 602
- Subjects: ENZIMAS HIDROLÍTICAS; FUNGOS; LIPASE; BIOPROCESSOS
- Keywords: Bifunctional enzyme; Enzima bifuncional; Expressão heteróloga; Filamentous fungus; Fungo filamentoso; Produção selvagem; Protease; Wild production; Heterologous expression
- Language: Português
- Abstract: As hidrolases, principalmente as peptidases e lipases, são responsáveis pelo alto faturamento no mercado mundial e pelos diversos empregos industriais e biotecnológicos. A obtenção destas proteínas ocorre pela aplicação dos microrganismos a bioprocessos, tanto de forma selvagem quanto por expressão heteróloga. Neste contexto, existe uma busca incessante por enzimas mais estáveis e com maior atividade catalítica, e algumas técnicas têm sido utilizadas para o melhoramento destes parâmetros. A obtenção da peptidase e lipase pelo fungo Fusarium oxysporum foi realizada por bioprocesso submerso, gerando picos de 165 U/mL em 72 horas e 633 U/mL em 48 horas, respectivamente. A peptidase foi purificada utilizando a resina Sephadex G-50 de exclusão de massa e caracterizada utilizando um substrato peptídico com supressão intramolecular de fluorescência. A classe da proteína foi determinada como serino peptidase e demonstrou características neutra e estável quanto ao pH em uma faixa ampla. A temperatura ótima foi de e 50 °C e a partir dos ensaios de estabilidade térmica foi evidenciado a manutenção da atividade proteolítica de 60-90% até 60 °C no período de uma hora. Quanto à eficiência catalítica, os subsítios S1, S2 e S'1 tem certa especificidade, pois não demonstram eficiência catalítica quando há a presença dos seguintes aminoácidos nas respectivas posições dos substratos P1 (ácido aspártico, prolina e isoleucina), P2 (ácido aspártico, histidina, lisina, asparagina e triptofano) eP'1 (ácido aspártico, ácido glutâmico e prolina), ao contrário dos subsítios S3, S'2 e S'3, onde todos aminoácidos apresentaram eficiência catalítica. A lipase foi purificada utilizado resina iônica e apresentou características básica e estabilidade em pH neutro, sua temperatura ótima foi de 35 °C e manutenção da atividade catalítica em pelo mens 50% após 1 hora de exposição a 25 a 40 °C. A produção da quimera deu-se pela busca de uma peptidase e uma lipase provenientes do fungo F. oxysporum no banco de dados, elas foram então fusionadas utilizando um linker composto por cinco aminoácidos (GGAGG) nas regiões C-terminal da peptidase e N-terminal da lipase. Ambas atividades foram detectadas na quimera, tornando-a funcional. A aplicação biotecnológica de ambas enzimas selvagens e recombinante é um passo importante para inovação, e de acordo com as características apresentadas cada enzima pode ser aplicada a diversos processos industriais, desde detergentes a biorremediação
- Imprenta:
- Publisher place: Ribeirão Preto
- Date published: 2017
- Data da defesa: 05.06.2017
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ABNT
SIQUEIRA, Ana Claudia Rodrigues de. Produção de peptidase e lipase nativas por Fusarium oxysporum e obtenção de uma quimera recombinante de peptidase e lipase expressa em Pichia pastoris. 2017. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2017. Disponível em: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60138/tde-07082017-112435/. Acesso em: 28 abr. 2024. -
APA
Siqueira, A. C. R. de. (2017). Produção de peptidase e lipase nativas por Fusarium oxysporum e obtenção de uma quimera recombinante de peptidase e lipase expressa em Pichia pastoris (Tese (Doutorado). Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60138/tde-07082017-112435/ -
NLM
Siqueira ACR de. Produção de peptidase e lipase nativas por Fusarium oxysporum e obtenção de uma quimera recombinante de peptidase e lipase expressa em Pichia pastoris [Internet]. 2017 ;[citado 2024 abr. 28 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60138/tde-07082017-112435/ -
Vancouver
Siqueira ACR de. Produção de peptidase e lipase nativas por Fusarium oxysporum e obtenção de uma quimera recombinante de peptidase e lipase expressa em Pichia pastoris [Internet]. 2017 ;[citado 2024 abr. 28 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60138/tde-07082017-112435/
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