L-DOPA extradiol dioxigenase de amanita muscaria: revisão da sequência codificadora, expressão heteróloga, caracterização funcional e contextualização filogenética (2019)
- Authors:
- Autor USP: SOARES, DOUGLAS MORAES MENDEL - IQ
- Unidade: IQ
- Sigla do Departamento: QBQ
- Subjects: ENZIMAS; FILOGENIA; CINÉTICA; PIGMENTOS; EXPRESSÃO GÊNICA
- Agências de fomento:
- Language: Português
- Abstract: Extradiol dioxigenases são enzimas que catalisam a clivagem oxidativa de ligações C-C entre grupos hidroxila fenólicos adjacentes utilizando catecóis como substratos. Esta classe de enzimas é bem caracterizada em bactérias, onde catalisam a degradação de compostos aromáticos. Na maioria das plantas Caryophyllales, como a beterraba, primavera e a maravilha, L-3,4-diidroxifenilalanina (L-DOPA) extradiol dioxigenases (DODAs) catalisam a clivagem oxidativa de L-DOPA na posição 4,5 gerando o ácido betalâmico, aldeído precursor das betalaínas, uma classe de pigmentos naturais que substitui as antocianinas na pigmentação dessas espécies. Alguns fungos basidiomicetos também produzem betalaínas, como o agário-das-moscas (Amanita muscaria). Nesse organismo, DODA é capaz de catalisar uma clivagem adicional na posição 2,3 da L-DOPA, formando muscaflavina, um isômero do ácido betalâmico que dá origem a uma outra classe de pigmentos naturais: as higroaurinas. Desde a caracterização do gene dodA, o qual codifica para a DODA de A. muscaria (AMAMU), não existem relatos na literatura que explorem a promiscuidade catalítica desta enzima, sua relação com outras linhagens de DODAs e a síntese quimioenzimática de betalaínas a partir desta enzima. Dessa forma, buscamos contextualizar as relações filogenéticas e funcionais entre AMAMU e diferentes linhagens de DODAs, bem como estabelecer um método que viabilize a clonagem, expressão heteróloga e caracterização funcional destaenzima. As análises filogenéticas revelaram que AMAMU possui uma evolução convergente com DODAs de plantas e bactérias e que, apesar de AMAMU ser funcionalmente homóloga à DODA da bactéria Escherichia coli, esta última apresenta homologia com DODAs de plantas. Logo, não há uma relação direta entre a sequência primária de DODAs e sua função. Nós também demonstramos que não há uma relação entre aexpressão de transcritos de BvDODA1, e de seu parálogo BvDODA2, e a diferença de pigmentação entre variedades de beterrabas amarelas e vermelhas. A clonagem da sequência codificadora (CDS) publicada para o gene dodA de A. muscaria resultou na retenção do primeiro íntron, o que impedia a sua expressão. Então, uma nova CDS de 558 nucleotídeos foi proposta para este gene, a qual inclui um códon de início da tradução que se mantém na fase de leitura e codifica para uma proteína de 185 resíduos, 43 a menos que AMAMU. A expressão desta CDS resultou na proteína recombinante AmDODA, capaz de catalisar a síntese de ácido betalâmico e muscaflavina a partir de L-DOPA e D-DOPA. AmDODA possui um tamanho aproximado de 22 kDa, com um pH ótimo de atividade de 8,5 e uma constante de Michaelis (‘K IND.M’) de 3,7 ± 0,9 mmol ‘L POT.-1’ e de velocidade máxima (‘V IND.MAX’) de 3,3 ± 0,4 µ mol ‘min POT.-1’ ‘mg POT.-1’. Sua utilização foi demonstrada na síntese quimioenzimática de betalaínas-modelo com potencial aplicação como sondas para microscopia confocal de fluorescência de dois fótons. Neste contexto, esta Tese explora os aspectos moleculares, bioquímicos e biológicos da DODA do fungo A. muscaria e traz importantes contribuições acerca da pigmentação por betalaínas na natureza
- Imprenta:
- Data da defesa: 07.03.2019
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ABNT
SOARES, Douglas Moraes Mendel. L-DOPA extradiol dioxigenase de amanita muscaria: revisão da sequência codificadora, expressão heteróloga, caracterização funcional e contextualização filogenética. 2019. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo, São Paulo, 2019. Disponível em: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-04072019-091912/. Acesso em: 03 maio 2024. -
APA
Soares, D. M. M. (2019). L-DOPA extradiol dioxigenase de amanita muscaria: revisão da sequência codificadora, expressão heteróloga, caracterização funcional e contextualização filogenética (Tese (Doutorado). Universidade de São Paulo, São Paulo. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-04072019-091912/ -
NLM
Soares DMM. L-DOPA extradiol dioxigenase de amanita muscaria: revisão da sequência codificadora, expressão heteróloga, caracterização funcional e contextualização filogenética [Internet]. 2019 ;[citado 2024 maio 03 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-04072019-091912/ -
Vancouver
Soares DMM. L-DOPA extradiol dioxigenase de amanita muscaria: revisão da sequência codificadora, expressão heteróloga, caracterização funcional e contextualização filogenética [Internet]. 2019 ;[citado 2024 maio 03 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-04072019-091912/ - Biosynthetic potential of the mushroom Gymnopilus imperialis - A metabolomic and genomic approach
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