Inserção de gene repórter fluorescente em região gênica de SOX2 para estudo da diferenciação celular no desenvolvimento embrionário inicial bovino (2021)
- Authors:
- Autor USP: LUEDKE, FELIPE EDUARDO - FMVZ
- Unidade: FMVZ
- Sigla do Departamento: VRA
- DOI: 10.11606/D.10.2021.tde-13122021-131957
- Subjects: BLASTOCISTO; BOVINOS; GENES
- Keywords: Blastocyst; CRISPR/Cas9; Gene editing; Homologous Recombination
- Agências de fomento:
- Language: Português
- Abstract: A separação entre massa interna celular (MCI) e trofectoderma (TE) é o primeiro evento de diferenciação celular que ocorre no embrião mamífero, seguida pela diferenciação na MCI do epiblasto (EPI) e endoderma primitivo (PE). Falhas nestes processos de desenvolvimento inicial podem ocasionar perdas embrionárias e consequentemente econômicas. A influência do sistema de produção embrionária nos primeiros eventos de diferenciação celular precisa ser mais elucidada, refletindo em índices que ainda podem ser melhorados na produção de embriões bovinos in vitro. O soro fetal bovino (SFB), apesar de seus efeitos deletérios sobre fatores epigenéticos, ainda é usado em sistemas de produção in vitro e pode influenciar esta diferenciação. Ainda, as técnicas para estudo dos embriões normalmente envolvem a destruição dos mesmos e não permitem acompanhar em tempo real a dinâmica de expressão dos genes relacionados à diferenciação em MCI e TE. Novas técnicas como CRISPR/Cas9 permitem alteração direcionada da sequência de DNA genômico, assim, a introdução direcionada de proteínas fluorescentes repórteres permitiria a visualização em tempo real da expressão de genes de interesse nos embriões. Diante disso, nossos objetivos foram: testar a influência do soro fetal bovino nas primeiras diferenciações e, realizar a inserção dirigida de uma proteína repórter fluorescente na região do gene SOX2 por recombinação homóloga. Ainda, comparamos a eficiência da inserção gênica com uso do sistema CRISPR emdiferentes momentos do desenvolvimento embrionário, com diferentes horários pós inseminação e com diferentes concentrações de material injetado. No primeiro experimento observamos que a retirada do SFB do cultivo embrionário não causa alterações na alocação de células na MCI ou TE, quando se alia esta remoção à renovação de uma parte do meio de cultivo às 90 horas pós inseminação (hpi). A ausência de suplementação de SFB ou de meio de cultivo levou à diminuição das células do TE, entretanto não alterou o número de células do PE. No segundo experimento, nenhum embrião produzido apresentou fluorescência, portanto todos os blastocistos tiveram seu DNA extraído para genotipagem. Foi realizada uma amostragem, e de 34 embriões verificados, um apresentou banda correspondente ao local do inserto e também banda correspondente ao embrião controle (wild type), sugerindo mosaicismo. Ao final, observamos que as melhores probabilidades de inserção gênica nos embriões bovinos aconteceram quando a injeção dos componentes do sistema CRISPR foi realizada após 8 horas de FIV e com maiores concentrações. Em conclusão, pudemos remover o SFB do nosso sistema de produção de embriões e surpreendentemente o SFB não influenciou a diferenciação em PE. Ainda, são necessários maiores estudos a fim de se otimizar a ferramenta para a obtenção de knock-in em embriões bovinos, principalmente para que se obtenha taxas de maior sucesso e redução da probabilidade de ocorrência de mosaicismo nestes embriões.
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- Data da defesa: 03.11.2021
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- Cor do Acesso Aberto: gold
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ABNT
LUEDKE, Felipe Eduardo. Inserção de gene repórter fluorescente em região gênica de SOX2 para estudo da diferenciação celular no desenvolvimento embrionário inicial bovino. 2021. Dissertação (Mestrado) – Universidade de São Paulo, São Paulo, 2021. Disponível em: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/10/10131/tde-13122021-131957/. Acesso em: 29 maio 2024. -
APA
Luedke, F. E. (2021). Inserção de gene repórter fluorescente em região gênica de SOX2 para estudo da diferenciação celular no desenvolvimento embrionário inicial bovino (Dissertação (Mestrado). Universidade de São Paulo, São Paulo. Recuperado de https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/10/10131/tde-13122021-131957/ -
NLM
Luedke FE. Inserção de gene repórter fluorescente em região gênica de SOX2 para estudo da diferenciação celular no desenvolvimento embrionário inicial bovino [Internet]. 2021 ;[citado 2024 maio 29 ] Available from: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/10/10131/tde-13122021-131957/ -
Vancouver
Luedke FE. Inserção de gene repórter fluorescente em região gênica de SOX2 para estudo da diferenciação celular no desenvolvimento embrionário inicial bovino [Internet]. 2021 ;[citado 2024 maio 29 ] Available from: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/10/10131/tde-13122021-131957/ - Use of CRISPR/Cas9 for deletion of the LATS2 gene in bovine embryos: preliminary results
- Metabolic effects of fetal bovine serum removal on in vitro culture of bovine embryos
- Efeito da inibição dos receptores de fator de crescimento fibroblástico na diferenciação do endoderma primitivo em embriões bovinos
- Efeito do fator de crescimento de fibroblasto 4 (FGF4) na diferenciação do endoderma primitivo em embriões bovinos
Informações sobre o DOI: 10.11606/D.10.2021.tde-13122021-131957 (Fonte: oaDOI API)
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