Caracterização funcional de linfócitos T-CAR anti-CD19 polarizados para o fenótipo Th17 através da superexpressão de RORγt (2022)
- Authors:
- Autor USP: BRAND, HELOISA - FMRP
- Unidade: FMRP
- Sigla do Departamento: RIO
- DOI: 10.11606/D.17.2022.tde-01122022-114546
- Subjects: LINFÓCITOS; RECEPTORES CELULARES; LEUCEMIA
- Keywords: CD19; Chimeric antigen receptor; IL-17; Receptor de antígeno quimérico; RORγt; T helper 17
- Agências de fomento:
- Language: Português
- Abstract: A transferência adotiva de linfócitos T modificados para expressar receptores de antígeno quiméricos (CAR) anti-CD19 tem resultado em taxas de remissão completa superiores a 80% em pacientes com leucemia linfoblástica aguda de células B. Entretanto, a resposta clínica é inferior (~30%) mesmo em outras neoplasias de células B, como a leucemia linfocítica crônica. Em tumores sólidos, o desafio é ainda maior, pois as células T-CAR apresentam-se ineficientes devido à baixa persistência, dificuldade de infiltração e exaustão funcional. Como alternativa para elevar a eficácia das células T-CAR, evidências pré-clínicas indicam que linfócitos polarizados para o fenótipo T helper 17 (Th17) são mais eficientes na erradicação de tumores do que células Th1. A polarização para Th17 in vitro envolve o cultivo das células com coquetel de citocinas e anticorpos neutralizantes, que é um processo dispendioso para a manufatura de células T-CAR. Em resposta às citocinas, o fator de transcrição receptor órfão relacionado ao ácido retinoico gama 2 (RORγt) orquestra a polarização para Th17. Assim, hipotetizamos que a coexpressão do CAR e de RORγt em células T humanas geraria células T-CAR com fenótipo Th17. Para testar nossa hipótese, produzimos vetores lentivirais contendo os genes codificantes do CAR anti-CD19 e/ou RORγt (para produção das rTh17-CAR). Para fins de comparação, também estabelecemos o método de polarização em Th17 por cultivo com citocinas e anticorpos (cTh17). Após a transdução, avaliamos a citotoxicidade das células T-CAR in vitro e in vivo contra células Raji modificadas para expressar luciferase. A citotoxicidade in vitro foi monitorada durante cocultivo com células Raji pela quantificação da bioluminescência e a liberação de IL-17 e IFN-γ foi mensurada por ELISA.Durante o estabelecimento da polarização em Th17 por citocinas, observamos que o uso do agonista de RORγt aumentou em ~45% a transcrição de IL-17A, sem alterar a transcrição de RORC2. Portanto, adicionamos o agonista de RORγt ao protocolo de produção das cTh17. Após transdução para expressar CAR e/ou RORγt, células cTh17-CAR, rTh17-CAR e CD4-CAR misturadas com células CD8-CAR na proporção 1:1 apresentaram citotoxicidade in vitro semelhante contra células de linfoma CD19+. Observamos também que as células CD4-CAR e cTh17-CAR exibem citotoxicidade na ausência de células CD8. Ainda, a coexpressão de CAR e RORγt gerou células T-CAR com perfil Th17, definido pela secreção de IL-17 (~1000 pg/mL/24h). A secreção de IL-17 por células cTh17 foi de ~2000 pg/mL/24h e células não polarizadas apresentaram secreção insignificante. Em um modelo in vivo de linfoma disseminado, as populações rTh17-CAR/CD8-CAR e cTh17-CAR/CD8-CAR apresentaram uma capacidade antitumoral inferior às CD4-CAR/CD8-CAR convencionais, indicando que a atividade superior das Th17 antitumorais pode depender do tipo de neoplasia. Compreender essas particularidades é essencial para aproveitar ao máximo o potencial terapêutico das células Th17. Concluímos que a superexpressão de RORγt gera células com perfil Th17, cuja eficácia tem sido demonstrada em modelos pré-clínicos de neoplasias sólidas. Nossos dados estabelecem uma estratégia simplificada para manufatura de células T-CAR com fenótipo Th17, que pode ser aplicada para avaliação da eficácia terapêutica desta população em outras neoplasias
- Imprenta:
- Publisher place: Ribeirão Preto
- Date published: 2022
- Data da defesa: 27.09.2022
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- Cor do Acesso Aberto: gold
- Licença: cc-by-nc-sa
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ABNT
BRAND, Heloisa. Caracterização funcional de linfócitos T-CAR anti-CD19 polarizados para o fenótipo Th17 através da superexpressão de RORγt. 2022. Dissertação (Mestrado) – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2022. Disponível em: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17153/tde-01122022-114546/. Acesso em: 13 maio 2024. -
APA
Brand, H. (2022). Caracterização funcional de linfócitos T-CAR anti-CD19 polarizados para o fenótipo Th17 através da superexpressão de RORγt (Dissertação (Mestrado). Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. Recuperado de https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17153/tde-01122022-114546/ -
NLM
Brand H. Caracterização funcional de linfócitos T-CAR anti-CD19 polarizados para o fenótipo Th17 através da superexpressão de RORγt [Internet]. 2022 ;[citado 2024 maio 13 ] Available from: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17153/tde-01122022-114546/ -
Vancouver
Brand H. Caracterização funcional de linfócitos T-CAR anti-CD19 polarizados para o fenótipo Th17 através da superexpressão de RORγt [Internet]. 2022 ;[citado 2024 maio 13 ] Available from: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17153/tde-01122022-114546/ - Development of a platform for tracking CAR-T cell persistence using qPCR and multiparametric flow cytometry for preclinical and clinical studies
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Informações sobre o DOI: 10.11606/D.17.2022.tde-01122022-114546 (Fonte: oaDOI API)
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