Menu



Exportar registro bibliográfico

Metrics:

Tese

Accessing transcriptional regulation of Escherichia coli biofilm formation using promoter and genomic libraries (2023)

  • Authors:
  • Autor USP: MEDEIROS, ANANDA SANCHES - FMRP
  • Unidade: FMRP
  • Sigla do Departamento: RBP
  • DOI: 10.11606/T.17.2023.tde-08082023-144205
  • Subjects: BIOFILMES; ESCHERICHIA COLI; GENES
  • Keywords: Biofilm; Gene expression regulation; Promoters; Promotores; Regulação da expressão gênica; SortSeq
  • Agências de fomento:
  • Language: Inglês
  • Abstract: Biofilmes são estruturas complexas formadas por comunidades bacterianas da mesma ou de espécies diferentes, embebidas em uma matriz extracelular composta por substâncias extracelulares poliméricas (EPS), como polissacarídeos, proteínas (como estruturas curli) e ácidos nucléicos. As redes reguladoras da formação do biofilme são compostas pela integração de estímulos ambientais e intracelulares. Uma de suas camadas é a regulação transcricional, que é capaz de alterar drasticamente a expressão gênica bacteriana, convertendo-a de um estilo de vida livre para um comportamento séssil. Para entender melhor como os genes relacionados ao biofilme são regulados por diferentes fatores de transcrição, decidimos aplicar a técnica de SortSeq para investigar a fundo a arquitetura de promotores centrais relacionados à formação de biofilme. Iniciamos este trabalho com 21 promotores, associados diretamente ao desenvolvimento do biofilme e motilidade bacteriana. Construímos e testamos uma biblioteca contendo esses 21 promotores mutados aleatoriamente a uma taxa de 10%. Os testes preliminares mostraram que esta biblioteca possuía muitas mutações e truncamentos das sequências promotoras, e poucas variantes, inviabilizando a aquisição de resultados com ela. Desta forma, decidimos focar em dois principais promotores de genes relacionados à síntese de curli: csgBAp e csgDp. Seus promotores estão restritos a uma mesma região intergênica e possuem uma relação estrita, uma vez que CsgD é um regulador mestre da transcrição do operon csgBA. Dividimos essa região intergênica em quatro partes e construímos bibliotecas com mutações focalizadas e aleatórias. Essas quatro bibliotecas foram inseridas individualmente nos promotores originais, os quais já haviam sido clonados em um plasmídeo de baixo número de cópias e modulam a expressão dos genes repórteres sfgfp e mCherry(plasmídeo csgBD-repórter). Para acessar como as mutações do promotor podem afetar a expressão de cada gene, transformamos as quatro bibliotecas na linhagem de E. coli W3110 RpoS+ e as cultivamos até a fase estacionária. Reproduzindo a técnica SortSeq, as culturas foram analisadas por citometria de fluxo e classificadas em quatro tubos de acordo com sua fluorescência para sfGFP, mCherry, sfGFP e mCherry, e negativo (sem expressão para ambos os repórteres). Triplicatas deste experimento tiveram seus plasmídeos extraídos e sequenciados usando a plataforma Illumina. Este novo design de biblioteca e abordagem SortSeq nos permitiu entender melhor como cada região promotora pode afetar a expressão de ambos os genes individual e conjuntamente, ajudando-nos a confirmar ou negar a atuação de sítios de ligação a fatores de transcrição já descritos. Também encontramos novos possíveis sítios de ligação para fatores de transcrição ainda não descritos, os quais foram utilizados para a predição de novos reguladores para esses promotores. Para expandir a investigação dos promotores csgBA e csgD construímos uma biblioteca genômica da cepa E. coli W3110 RpoS+, usando um plasmídeo contendo a transposase Tn5 e sequencias de DNA como código de barras. A transposase Tn5 presente no plasmídeo insere aleatoriamente um código de barras único em uma região única do DNA genômico. Em seguida, mapeamos o código de barras para sua região genômica correspondente, permitindo a identificação do sítio mutado apenas pelo sequenciamento do código de barras. Transformamos nosso plasmídeo csgBD-reporter (sem qualquer inserção de biblioteca) na biblioteca e usamos a abordagem SortSeq para dividir as bactérias nos mesmos quatro fenótipos e sequenciar o código de barras inserido por meio da técnica NGS. Esta segunda abordagem levou à identificação de novos atores naregulação gênica desses genes tão importantes associados à formação do biofilme. Combinando esses dois tipos de bibliotecas, descobrimos possíveis novas regulações dos promotores de csgBA e csgD que serão testados e confirmados futuramente
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 31.05.2023
    • Acesso à fonteAcesso à fonteDOI
    Informações sobre o DOI: 10.11606/T.17.2023.tde-08082023-144205 (Fonte: oaDOI API)
    • Este periódico é de acesso aberto
    • Este artigo é de acesso aberto
    • URL de acesso aberto
    • Cor do Acesso Aberto: gold
    • Licença: cc-by-nc-sa
    How to cite
    A citação é gerada automaticamente e pode não estar totalmente de acordo com as normas

    • ABNT

      MEDEIROS, Ananda Sanches. Accessing transcriptional regulation of Escherichia coli biofilm formation using promoter and genomic libraries. 2023. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2023. Disponível em: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17136/tde-08082023-144205/. Acesso em: 28 abr. 2024.

    • APA

      Medeiros, A. S. (2023). Accessing transcriptional regulation of Escherichia coli biofilm formation using promoter and genomic libraries (Tese (Doutorado). Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. Recuperado de https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17136/tde-08082023-144205/

    • NLM

      Medeiros AS. Accessing transcriptional regulation of Escherichia coli biofilm formation using promoter and genomic libraries [Internet]. 2023 ;[citado 2024 abr. 28 ] Available from: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17136/tde-08082023-144205/

    • Vancouver

      Medeiros AS. Accessing transcriptional regulation of Escherichia coli biofilm formation using promoter and genomic libraries [Internet]. 2023 ;[citado 2024 abr. 28 ] Available from: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17136/tde-08082023-144205/

    Últimas obras dos mesmos autores vinculados com a USP cadastradas na BDPI:

Digital Library of Intellectual Production of Universidade de São Paulo     2012 - 2024