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Tese

Novos transposons para construção de fusões com GFP em candida albicans: um estudo fenotípico e de localização da septina Cdc3 (2006)

  • Authors:
  • Autor USP: DIAS, MARCOS VINICIOS SALLES - FMRP
  • Unidade: FMRP
  • Sigla do Departamento: RBP
  • Subjects: CANDIDA ALBICANS; GENÉTICA MICROBIANA; GENÉTICA MOLECULAR
  • Language: Português
  • Abstract: Candida albicans é o mais prevalente fungo oportunista que causa infecções superficiais ou em mucosas ou infecções sistêmicas em pacientes imunocomprometidos. O recente seqüenciamento do genoma diplóide de C. albicans e o desenvolvimento de novas metodologias moleculares tem permitido a identificação e a análise de novos fatores de virulência. Neste trabalho desenvolvemos três novas transposons para obtenção de inserções aleatórias de seqüencias codificadoras de GFP (green fluorescent protein) no genoma ou especificamente em algum gene clonado de interesse para determinação da localização subcelular das proteínas de fusão por microscopia de fluorescência. Testamos um dos nossos transposons para uma reação de transposição in vitro utilizando como gene alvo CDC3 que codifica uma septina. Após a transposição, os clones selecionados foram submetidos a uma preparação de DNA plasmidial e digeridos com a enzima NotI que flanqueia o inserto. De 96 clones analisados 40 possuiam inserções dentro do gene CDC3 e destes o seqüenciamento revelou 6 inserções in-frame em diferentes pontos dentro da seqüencia de aminoácidos de Cdc3. Estes alelos foram transferidos para o genoma diplóide de C.albicans por recombinação homóloga após digestão dos sítios flanqueadores da enzima NotI. Os transformantes obtidos foram submetidos a análise fenotípica e localização subcelular por microscopia de fluorescência em três diferentes condições de crescimento: 30°C (leveduras), 37°C(pseudo-hifa) e 37°C + soro (hifa). Duas inserções individuais próximos à região C - terminal mostraram células com morfologia similar ao tipo selvagem e com a proteína de fusão septina-GFP localizada tipicamente como um anel no gargalo entre a célula mãe e a célula filha. Mas em algumas células nos detectamos uma localização irregular em pontos na extremidade do broto em crescimento. Em contraste outras 4 inserções in - frame localizadas no domínio central ou na região N-terminal de Cdc3p mostraram fenótipos dominantes: brotos alongados em células crescendo a 30°C e citocinese incompleta em células de pseudohifa. Nós não detectamos sinal de GFP. nestes mutantes, indicando que a proteína de fusão não estava corretamente localizada ou é instável. Assim, por gerar um grupo de indivíduos fusões com GFP dentro da seqüencia da proteína, nosso transposon serve como uma ferramenta versátil e para dissecar função de domínios protéicos e localização subcelular de proteínas
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 01.12.2006
    • How to cite
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    • ABNT

      DIAS, Marcos Vinicios Salles. Novos transposons para construção de fusões com GFP em candida albicans: um estudo fenotípico e de localização da septina Cdc3. 2006. Dissertação (Mestrado) – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2006. . Acesso em: 24 abr. 2024.

    • APA

      Dias, M. V. S. (2006). Novos transposons para construção de fusões com GFP em candida albicans: um estudo fenotípico e de localização da septina Cdc3 (Dissertação (Mestrado). Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto.

    • NLM

      Dias MVS. Novos transposons para construção de fusões com GFP em candida albicans: um estudo fenotípico e de localização da septina Cdc3. 2006 ;[citado 2024 abr. 24 ]

    • Vancouver

      Dias MVS. Novos transposons para construção de fusões com GFP em candida albicans: um estudo fenotípico e de localização da septina Cdc3. 2006 ;[citado 2024 abr. 24 ]

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