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Criopreservação de embriões bovinos micromanipulados e sexados pela técnica de primer extension preamplification-polymerase chain reaction (PEP-PCR) (1999)

  • Authors:
  • USP affiliated authors: HASSUN FILHO, PERICLES ASSAD - FMVZ
  • USP Schools: FMVZ
  • Sigla do Departamento: VRA
  • Subjects: REPRODUÇÃO ANIMAL
  • Language: Português
  • Abstract: A sexagem de embriões baseada na metodologia de PCR é realidade na indústria de transferência de embriões. Contudo, tem-se obtido baixa taxa de gestação com embriões congelados e biopsiados com lâmina, independente da técnica de criopreservação empregada. Empregando a microaspiração com pipetas de vidro há incremento dos resultados, porém a eficiência da sexagem é reduzida. Seqüências de cópia única tem sido adequadas para sexagem, mas estas, ocasionalmente, falham na amplificação devido ao pequeno número de moléculas de DNA. Enquanto o uso de sequências repetitivas Y-específicas aumenta o produto de PCR, a existência de sequências homólogas no cromossomo X pode ser fonte de erro. Este estudo foi feito com o objetivo de avaliar o emprego da técnica de "primer extension preamplifcation - polymerase chain reaction" (PEP-PCR) na sexagem de embriões micromanipulados por aspiração e congelados. No primeiro experimento verificou-se a eficiência da amplificação do DNA de biópsias de embriões bovinos através da técnica de PEP-PCR. Cinqüenta blastocistos produzidos "in vitro" foram microaspirados (remoção de 2 a 5 blastômeros) em meio contendo PBS + 0.4% de BSA. O material biopsiado foi transferido para microtubos de polipropileno (0,2ml) contendo 10'mü'l de água ultrapura e congelados a -80 graus C. Após a descongelação as biópsias foram submetidas a amplificação por PEP, que consistiu de múltiplos ciclos de extensão com oligonucleotídeos randômicos de 15 bases. Após a reaçãode PEP, alíquotas de 5'mü'l foram submetidas a sexagem por PCR, amplificando-se regiões específicas do cromossomo Y (BOV97M), seqüências repetitivas (BRY.4a) e região 1.715 sat-H autossomal bovina.Subsequentemente, o DNA total foi purificado do restante do blastocisto biopsiado, e submetido a sexagem por PCR (BRY.4a E 1.715 sat-H), sendo o grupo controle. A acurácia da sexagem foi determinada pela comparação dos resultados de PEP-PCR (continuação)de blastômeros microaspirados com o restante do embrião. Amplificação por PEP-PCR ocorreu em 96% (48/50) dos embriões biopsiados e eficiência da sexagem foi de 93,7% (45/50), não diferindo estatisticamente do grupo controle (p>0,05 - teste exato de Fisher). No segundo experimento verificou-se a taxa de gestação dos embriões bovinos produzidos "in vivo", micromanipulados, congelados em etileno glicol e sexados por PEP-PCR em condições de campo. A taxa de gestação foi de 34,5% (10/29) dosembriões biopsiados e congelados, sendo o controle (embriões congelados e não micromanipulados) de 33,3% (9/27). Não houve diferença estatística (p>0,05 - teste de Qui quadrado). A sexagem por PEP-PCR foi observada em 70% (7/10) dos embriões biopsiados. A taxa de gestação e sexagem fetal foi determinada por ultrasonografia aos 60 dias de gestação. Conclui-se que a metodologia de PEP-PCR para sexagem de embriões bovinos é factível, com a vantagem de possibilitar o diagnóstico de múltiplas características através de uma única biópsia.Os resultados inconsistentes de PEP-PCR obtidos por embriões produzidos "in vivo" provavelmente devem-se à perda da biópsia durante a micromanipulação e transferência para o tubo
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 11.02.1999

  • Exemplares físicos disponíveis nas Bibliotecas da USP
    BibliotecaCód. de barrasNúm. de chamada
    FMVZ11300025293T.765 FMVZ e.2
    How to cite
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    • ABNT

      HASSUN FILHO, Péricles Assad; GARCIA, José Fernando. Criopreservação de embriões bovinos micromanipulados e sexados pela técnica de primer extension preamplification-polymerase chain reaction (PEP-PCR). 1999.Universidade de São Paulo, São Paulo, 1999.
    • APA

      Hassun Filho, P. A., & Garcia, J. F. (1999). Criopreservação de embriões bovinos micromanipulados e sexados pela técnica de primer extension preamplification-polymerase chain reaction (PEP-PCR). Universidade de São Paulo, São Paulo.
    • NLM

      Hassun Filho PA, Garcia JF. Criopreservação de embriões bovinos micromanipulados e sexados pela técnica de primer extension preamplification-polymerase chain reaction (PEP-PCR). 1999 ;
    • Vancouver

      Hassun Filho PA, Garcia JF. Criopreservação de embriões bovinos micromanipulados e sexados pela técnica de primer extension preamplification-polymerase chain reaction (PEP-PCR). 1999 ;