Clonagem e caracterização de um novo gene de Trypanossoma cruzi que codifica uma proteína com motivos de 'alfa'-helice coiled-coil (2000)
- Authors:
- Autor USP: FREITAS, FERNANDO AUGUSTO DE - IQ
- Unidade: IQ
- Sigla do Departamento: QBQ
- Subjects: BIOLOGIA MOLECULAR; TRYPANOSOMA
- Language: Português
- Abstract: O presente estudo descreve a caracterização de um novo gene - denominado 1.1 - que é específico de T. cruzi. De fato esta seqüência não está representada no genoma de 13 espécies de tripanossomatídeos, incluindo-se T. brucei, T. rangeli e Leishmania. O gene 1.1 é um gene de múltiplas cópias (5 a 20 cópias) e está representado no genoma de oito diferentes cepas de T. cruzi, indicando sua ubiqüidade. Estas cópias estão localizadas em uma ou duas bandas cromossômicas, que diferem em tamanho de acordo com a cepa analisada. Um transcrito de tamanho molecular aparente de Skb correspondente ao gene 1.1 foi detectado no clone CL Brener e na cepa Y, enquanto para a cepa YuYu observa-se um mRNA menor, de cerca de 2,5 kb. O fragmento de 1,7 kb correspondente à região 5' do gene 1.1 foi originalmente isolado a partir de uma biblioteca de expressão de T. cruzi em 'lambda'. gt 11 usando-se na varredura um soro contra a glutationa S-transferase de S. japonicum. A proteína recombinante correspondente foi obtida após subclonagem em pEX e permitiu a obtenção de um antissoro em coelhos. Este soro reconheceu por Western blot um antígeno de massa molecular maior que 200 kDa e um de 66 kDa em lisados de formas epimastigotas da cepa Y. Este soro reagiu ainda com miosinas musculares de diferentes origens (mamíferos e galinha); mais especificamente, com a porção correspondente à cauda da miosina que apresenta motivos de 'alfa'-hélice coiled-coil. Estudos preliminares sugerem que aporção N-terminal da proteína codificada pelo gene 1.1 não é reconhecida por soros de pacientes chagásicos (cardiopatas e assintomáticos). A localização celular do antígeno 1.1 foi determinada por imunofluorescência indireta e imunomicroscopia eletrônica. Os dados indicam que este antígeno está distribuído no citopiasma de formas epimastigotas e amastigotas intracelulares. A localização em tripomastigotas não foi determinada. ) A presença do antígeno 1.1 também foi observada no interior de vesículas citoplasmátícas e, mais raramente, no núcleo dos parasitas. Várias fotos sugerem que a proteína 1.1 pode ser secretada/excretada por exocitose uma vez que ela foi observada no meio de epimastigotas e no citoplasma de células de mamífero em cultura infectadas com amastigotas. Visando isolar o gene 1.1 completo, o inserto de 1,7 kb foi utilizado como sonda na varredura de urna biblioteca genômica da cepa Y, contendo fragmentos de 16-20 kb. Quatro recombinantes foram isolados, sendo que um deles foi analisado em detalhe. Este recombinante contém uma cópia completa do gene 1.1 (9,7 kb) separada por 5,5 kb do início da outra cópia do mesmo gene, que neste recombinante está truncada. O seqüenciamento completo da cópia integral do gene 1.1 foi realizado, tido que este apresenta uma estrutura peculiar. A posição da metionina inicial e do codon de terminação foi deduzida a partir de dados de seqüenciamento e de mapas de transcrição. A porção codificadora, compreendida entreestas duas posições, apresenta 8220 pb, o que corresponderia a unia proteína de cerca de 300 kDa. Na porção central do 1.1 está localizada uma região que apresenta 13 repetições seriadas de 450 nucleotídeos, perfazendo cerca de 5,8 kb. A seqüência de nucleotídeos foi comparada com seqüências depositadas em dados, concluindo-se que o gene 1.1 não apresenta nenhuma identidade com interiormente clonados de T. cruzi ou de outros tripanossomatídeos, sendo, portanto, um gene inédito. Foi observada certa homologia com seqüências de aminoácidos da cadeia de miosinas de diferentes organismos. O alinhamento das seqüências, no entanto, não mostrou nenhum bloco de aminoácidos com identidade elevada. A aplicação de programas específicos para análise de estrutura de proteínas prediz a existência de regiões) ) que apresentam alta probabilidade de formação de estruturas de 'alfa'-hélice coiled-coil localizadas na porção amino-terminal, central e carboxi-terminal da proteína 1.1. Além disto, foram identificados domínios de zíper de leucina na região contendo as repetições seriadas de aminoácidos. Os dados obtidos não permitem atribuir à proteína 1.1 nenhuma atividade funcional seja enzimática, regulatória ou estrutural. No entanto, os subclones gerados a do gene 1.1 permitirão obter polipeptídeos correspondentes para a condução de estudos estruturais e funcionais
- Imprenta:
- Data da defesa: 21.01.2000
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ABNT
FREITAS, Fernando Augusto de. Clonagem e caracterização de um novo gene de Trypanossoma cruzi que codifica uma proteína com motivos de 'alfa'-helice coiled-coil. 2000. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo, São Paulo, 2000. . Acesso em: 24 abr. 2024. -
APA
Freitas, F. A. de. (2000). Clonagem e caracterização de um novo gene de Trypanossoma cruzi que codifica uma proteína com motivos de 'alfa'-helice coiled-coil (Tese (Doutorado). Universidade de São Paulo, São Paulo. -
NLM
Freitas FA de. Clonagem e caracterização de um novo gene de Trypanossoma cruzi que codifica uma proteína com motivos de 'alfa'-helice coiled-coil. 2000 ;[citado 2024 abr. 24 ] -
Vancouver
Freitas FA de. Clonagem e caracterização de um novo gene de Trypanossoma cruzi que codifica uma proteína com motivos de 'alfa'-helice coiled-coil. 2000 ;[citado 2024 abr. 24 ]
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