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Mapeamento dos sítios funcionais do subdomínio cauda globular da miosina-Va (2001)

  • Authors:
  • USP affiliated authors: SOUZA, ADRIANA MARIA MARIANO SILVEIRA E - FMRP
  • USP Schools: FMRP
  • Sigla do Departamento: RBP
  • Subjects: MIOSINA; BIOLOGIA CELULAR
  • Language: Português
  • Abstract: As miosinas da classe V são mecanoenzimas que se associam à F-actina e hidrolisam ATP para produzir força mecânica. Estas proteínas são diméricas e apresentam três domínios característicos: domínio motor (cabeça), domínio regulatório (pescoço) e domínio cauda, sendo este último dividido em três subdomínios distintos: proximal, medial e distal (globular): Assume-se que o subdomínio globular está envolvido na interação das miosinas da classeV com proteínas de ancoramento, desempenhando um papel na localização intracelular destas miosinas e/ou com proteínas receptoras localizadas na superfície de organelas. O presente trabalho teve como objetivo mapear os segmentos do subdomínio cauda globular da miosina-Va de cérebro de galinha envolvidos no endereçamento desta proteína ao centrossomo e a outros sítios subcelulares, notadamente o núcleo celular. Para isso, doze construções plasmideais foram geradas. Destas, oito codificavam diferentes regiões do cDNA do subdomínio cauda globular desta miosina em fusão com a "Enhanced Green Fluorescent Protein" (EGFP): MEN-SRV (aa. 1423-1830), DPE-SRV (aa. 1656-1830), MENDEG (aa. 1423-1632), LILMDP (aa. 1466-1657), DEG-MDP (aa. 1630-1657), MEN-MDP (aa. 1423-1657), MEN-ILE (aa. 1423-1469) e DEG-SRV (aa. 16301830). As outras construções codificavam, além de segmentos da cauda globular, os 47 resíduos de aminoácidos da cauda medial da miosina-Va: LQH-MDP (aa. 1376-1657) e LQH-SRV (aa. 1376-1830) em fusão com a EGFP. Osegmento LQH-SRV também foi clonado em fusão com a "Red Fluorescent Proteín" (RFP) e com o epitopo de cmyc. Células de melanoma B16-F10, S91-6 e S91-48, a células HeLa foram transfectadas com as construções plasmideais obtidas, e o padrão de expressão de cada subclone foi analisado por microscopia confocal e vídeo microscopia. As análises da localização subcelular das proteínas recombinantes LILMDP, MEN-MOP e MEN-DEG sugerem que a principal ) porção do sítio de endereçamento ao centrossomo, está localizada no início da porção N-terminal do subdomínio globular da miosina-Va, entre os aminoácidos 1423 e 1466. No entanto, o subclone MEN-ILE, o qual codifica exatamente esta região, não é enviado ao centrossomo, e sim ao núcleo celular, aparentemente seguindo o padrão de distribuição da EGFP, provavelmente por codificar uma região com poucos aminoácidos. Dentre as construções deste trabalho, a MEN-DEG (aa. 1423-1632), codificou a menor sequência de aminoácidos que é endereçada ao centrossomo. Comparando-se o padrão de distribuição subcelular das construções LQH-SRV, LQH-MDP e MEN-SRV, pode-se sugerir que os 47 resíduos de aminoácidos da cauda medial presentes nas duas primeiras construções sejam responsáveis por impedir a entrada dessas proteínas no núcleo celular, uma vez que o subclone MEN-SRV é endereçado à referida organela. A expressão da região carboxi-terminal da cauda globular, subclone DPE-SRV exibiu um padrão de distribuição pntilhado no citoplasmasugestivo de associação com partículas citoplasmáticas. Nas células tratadas com nocodazol objetivando a despolimeração dos microtúbulos, observou-se que segundos após a remoção da droga já havia nucleação destes microtúbulos. No entanto, as células que anteriormente ao tratamento com nocodazol foram transfectadas com a construção LQH-SRV, a qual possui localização centrossômica, apresentaram uma menor nucleação de microtúbulos em comparação com as células não transfectadas, sugerindo que a proteína codificada por este subclone possa estar de algum modo interferindo nesta nucleação dos microtúbulos. Esses dados confirmam que a localização da miosina-Va no centrossomo é dependente de microtúbulos, e fortalecem a noção que os motores moleculares de actina e de microtúbulos interagem entre si na realização dos movimentos celulares
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 05.09.2001

  • Exemplares físicos disponíveis nas Bibliotecas da USP
    BibliotecaCód. de barrasNúm. de chamada
    FMRP11200032149Souza, Adriana Maria M. S.
    How to cite
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    • ABNT

      SOUZA, Adriana Maria Mariano Silveira; ESPREAFICO, Enilza Maria. Mapeamento dos sítios funcionais do subdomínio cauda globular da miosina-Va. 2001.Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2001.
    • APA

      Souza, A. M. M. S., & Espreafico, E. M. (2001). Mapeamento dos sítios funcionais do subdomínio cauda globular da miosina-Va. Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto.
    • NLM

      Souza AMMS, Espreafico EM. Mapeamento dos sítios funcionais do subdomínio cauda globular da miosina-Va. 2001 ;
    • Vancouver

      Souza AMMS, Espreafico EM. Mapeamento dos sítios funcionais do subdomínio cauda globular da miosina-Va. 2001 ;