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Caracterização cinética da (Na+,K+)-ATPase da fração microsomal de tecido branquial de Callinectes danae (CRUSTACEA, PORTUNIDAE) (2002)

  • Authors:
  • USP affiliated authors: MASUI, DOUGLAS CHODI - FFCLRP
  • USP Schools: FFCLRP
  • Subjects: CRUSTACEA; BIOLOGIA AQUÁTICA
  • Language: Português
  • Abstract: A caracterização bioquímica da A (Na+,K+)-ATPase, uma importante enzima envolvida no controle osmo-iônico nos crustáceos osmorreguladores, foi realizada a partir de centrifugação diferencial de frações microsomais do tecido branquial do siri eurialino C. danae, coletado na Baía de Ubatuba e mantido a 33 de salinidade. A ultracentrifugação da fração microsomal em um gradiente contínuo de sacarose (10-50%) revelou a presença de um único pico de atividade (Na+, K+)-ATPase, coincidente com o pico de atividade K+-fosfatase. Ambas as atividades foram inibidas completamente pela ouabaína. O Western blotting da fração microsomal apresentou uma única banda imunoespecífica contra a subunidade a da (Na+, K+)-ATPase, sugerindo a presença de uma única isoforma para a cadeia a da enzima. A hidrólise do ATP ocorreu em sítios de alta afinidade que apresentaram interações sítio-sítio (nH=3,6) com uma atividade específica V= 35,4 ± 2,1 U/mg e K0,5= 54,0 ± 4,0 nM, bem como em sítios de baixa afinidade, que obedeceram uma cinética Michaeliana, com V= 271,5 ± 17,2 U/mg e KM= 55,0 ± 3,0 µM. A estimulação da atividade da enzima pelos íons Na+ (V= 302,1 ± 14,1 U/mg e K0,5= 5,80 ± 0,3 mM), Mg2+ (V= 309,7 ± 15,7 U/mg e K0,5= 0,48 ± 0,02 mM) e K+ (V= 294,0 ± 11,8 U/mg e K0,5= 1,61 ± 0,06 mM) ocorreu através de interações sítio-sítio, enquanto a estimulação pelos íons NH4+ obedeceu a uma cinética Michaeliana com V= 377,8 ± 22,7 U/mg e KM= 4,61 ± 0,27 mM). Interessantemente, os íons NH4+estimularam sinergisticamente a atividade específica da enzima em cerca de 90% (V= 557,0 ± 28,3 U/mg), sugerindo que esses íons se ligam em diferentes sítios na molécula. A (Na+,K+)-ATPase do tecido branquial de C. danae hidrolisou o PNFF com V= 125,4 ± 7,5 U/mg, K0,5= 1,2 ± 0,1 mM, através de interações cooperativas (nH 1,5). Além disso, essa atividade K+ -fosfatase foi inibida competitivamente pelo ATP (KF 57,2 ± 2,6 µM), sugerindo que os dois ) substratos foram hidrolisados no mesmo sítio da enzima. A estimulação da atividade K+-fosfatase da (Na+,K+)-ATPase pelos íons K+ (V= 121,0 ± 6,1 U/mg; K0,5= 2,1 ± 0,1 mM), Mg2+ (V= 125,3 ± 6,3 U/mg; K0,5= 1,0 ± 0,1 mM) e NH4+ (V= 126,1 ± 4,8 U/mg; K0,5= 13,7 ± 0,5 mM) ocorreram através de interações sítio-sítio, similarmente ao observado para o ATP. A ouabaína e o ortovanadato inibiram completamente a atividade (Na+,K+)-ATPase (KI= 147,2 ± 7,2 µM; KI 11,2 ± 0,6 µM, respectivamente). Entretanto, para a atividade K+-fosfatase os valores determinados foram significativamente superiores (KI 830,3 ± 42,5 µM ; KI 34,0 ± 1,4 nM, respectivamente). A inibição da atividade da (Na+,K+)-ATPase por essas duas substâncias foi afetada pela presença de íons NH4+. Entretanto, o mesmo não ocorreu com a atividade K+-fosfatase da enzima. A representação de Arrhenius revelou a ocorrência de uma transição de fase próximo a 19°C, com ?H1= 15.939 cal/mol e outra a 38°C com ?H2 = 7.719 cal/mol. Temperaturas acima de 43°C provocaram uma rápidainativação da (Na + ,K+)-ATPase. Esta é a primeira demonstração da presença de um sítio de alta afinidade para o ATP na (Na+,K+)-ATPase de crustáceo. Os resultados obtidos sugerem que as atividades (Na+,K+)-ATPase e K+-fosfatase pertencem à mesma enzima e que a preparação não apresenta contaminações por outras ATPases e/ou fosfatases. Do ponto de vista fisiológico, os resultados deste trabalho são relevantes em relação à excreção ativa dos íons NH4+ pelos crustáceos
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 04.09.2002
  • Acesso online ao documento

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    Exemplares físicos disponíveis nas Bibliotecas da USP
    BibliotecaCód. de barrasNúm. de chamada
    FCLRP20800044269Masui, Douglas Chodi
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    • ABNT

      MASUI, Douglas Chodi; LEONE, Francisco de Assis. Caracterização cinética da (Na+,K+)-ATPase da fração microsomal de tecido branquial de Callinectes danae (CRUSTACEA, PORTUNIDAE). 2002.Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2002. Disponível em: < http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/59/59139/tde-02022007-121223/ >.
    • APA

      Masui, D. C., & Leone, F. de A. (2002). Caracterização cinética da (Na+,K+)-ATPase da fração microsomal de tecido branquial de Callinectes danae (CRUSTACEA, PORTUNIDAE). Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/59/59139/tde-02022007-121223/
    • NLM

      Masui DC, Leone F de A. Caracterização cinética da (Na+,K+)-ATPase da fração microsomal de tecido branquial de Callinectes danae (CRUSTACEA, PORTUNIDAE) [Internet]. 2002 ;Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/59/59139/tde-02022007-121223/
    • Vancouver

      Masui DC, Leone F de A. Caracterização cinética da (Na+,K+)-ATPase da fração microsomal de tecido branquial de Callinectes danae (CRUSTACEA, PORTUNIDAE) [Internet]. 2002 ;Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/59/59139/tde-02022007-121223/