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Enzima purina nucleosídeo fosforilase de Schistosoma mansoni: estruturas cristalograficas, estudos cineticos e descoberta de novos ligantes (2003)

  • Authors:
  • USP affiliated authors: PEREIRA, HUMBERTO D MUNIZ - IFSC
  • USP Schools: IFSC
  • Subjects: ENZIMAS
  • Language: Português
  • Abstract: O parasita Schistosoma mansoni não possui a via de síntese de bases púricas e depende integralmente da via de salvação de purinas para o seu requerimento de purinas. Uma das enzimas participantes desta via é a Purina Nucleosídeo Fosforilase (PNP) (E.C. 2.4.2.1). A PNP catalisa a fosforólise reversível de nucleosídeos de purina para gerar a base correspondente e ribose-1-fosfato. No Projeto Genoma de Schistosoma mansoni, o gene para esta enzima foi identificado. O cDNA para a PNP de S. mansoni (SmPNP), possui 1055pb e codifica para uma proteína de 287 aminoácidos, que possui 49% de identidade quando comparada a PNP de eritrócitos humana ou de baço bovino. O gene foi clonado no vetor de expressão pMAL C2G, e expresso na forma de uma proteína de fusão, com MBP (80 mg/L). Após a purificação da proteína de fusão, a clivagem proteolítica das duas proteínas foi realizada utilizando-se o Factor Xa. A SmPNP foi então purificada utilizando uma coluna de troca cationica. Foram determinadas as constantes catalíticas para a fosforólise de inosina pela SmPNP, as quais são 3'mu'M para o 'K IND.M' e 222's POT.-1' para o 'k IND.cat'. O valor para o 'K IND.M' é o menor já descrito para uma PNP de baixa massa molecular. Foram obtidos cristais da SmPNP utilizando 18-24 % de PEG 1500, 20% de glicerol em 32mM de tampão acetato de sódio pH 4,9-5,0. Quando utilizado o aditivo NDSB195 na cristalização da SmPNP a solução de cristalização foi 28-30% de PEG 1500, 20% de glicerolem 32mM de tampão acetato de sódio pH 4,9-5,0. Cinco conjunto de dados de difração de raios X foram obtidos tanto na presença como na ausência de ligantes. A resolução deste conjuntos de dados variou de 2,75'Angstron' a 1,75'Angstron'. Todas estas estruturas foram resolvidas pelo método da substituição molecular, sendo que na primeira estrutura resolvida (a 2,75'Angstron') foi utilizado a estrutura da PNP bovina como modelo de busca, e na resolução das estruturas ) subsequentes foi utilizado a estrutura da SmPNP como modelo de busca. A estrutura da SmPNP a 1,75'Angstron' de resolução foi obtida a partir de um cristal crescido na presença de NDSB195, e após sua resolução foi encontrado este composto ligado em todos os sítios ativos da SmPNP via a sítio de ligação do fosfato. Foram também obtidas as estruturas da SmPNP na forma apo a 1,9'Angstron' de resolução e em complexo com fosfato a 2,0'Angstron' de resolução. Todas as estruturas foram utilizadas na comparação com outras PNPs de baixa massa molecular. Utilizando a estrutura da SmPNP a 1,75'Angstron' de resolução, foi realizada uma busca por compostos (Virtual Screening) que ligassem a SmPNP. Nesta busca foi utilizando o programa GOLD, utilizando uma base de dados de cerca de 36000 compostos com peso molecular inferior a 280 Da. Vinte e dois compostos foram selecionados com base no escore de docking e pelas interações (pontes de hidrogênio) com os resíduos chave do sítio ativo. Utilizando PNP bovina e amesma abordagem de docking foram selecionados 19 compostos. Estes compostos foram ensaiados contra a SmPNP e 12 compostos se mostraram capazes de inibir a SmPNP. Um complexo entre a SmPNP e o composto AT2169 (oriundo do VS) foi obtido e refinado. Esta abordagem foi validada utilizando ligantes conhecidos das PNPs.
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 22.12.2003
  • Acesso online ao documento

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    • ABNT

      PEREIRA, Humberto d'Muniz; GARRATT, Richard Charles. Enzima purina nucleosídeo fosforilase de Schistosoma mansoni: estruturas cristalograficas, estudos cineticos e descoberta de novos ligantes. 2003.Universidade de São Paulo, São Carlos, 2003. Disponível em: < http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76132/tde-09042008-143720/ >.
    • APA

      Pereira, H. d'M., & Garratt, R. C. (2003). Enzima purina nucleosídeo fosforilase de Schistosoma mansoni: estruturas cristalograficas, estudos cineticos e descoberta de novos ligantes. Universidade de São Paulo, São Carlos. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76132/tde-09042008-143720/
    • NLM

      Pereira H d'M, Garratt RC. Enzima purina nucleosídeo fosforilase de Schistosoma mansoni: estruturas cristalograficas, estudos cineticos e descoberta de novos ligantes [Internet]. 2003 ;Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76132/tde-09042008-143720/
    • Vancouver

      Pereira H d'M, Garratt RC. Enzima purina nucleosídeo fosforilase de Schistosoma mansoni: estruturas cristalograficas, estudos cineticos e descoberta de novos ligantes [Internet]. 2003 ;Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76132/tde-09042008-143720/