Fragmentos de tropomiosina-estudos da estabilidade conformacional e da interação cabeça-cauda (2003)
- Authors:
- Autor USP: PAULUCCI, ADRIANA APARECIDA - IQ
- Unidade: IQ
- Sigla do Departamento: QBQ
- Subjects: PROTEÍNAS MUSCULARES (ESTUDO); MIOSINA (ESTUDO); BIOFÍSICA
- Language: Português
- Abstract: A Tropomiosina (Tm) está diretamente envolvida no processo de regulação da contração muscular, que é controlado por um mecanismo alostérico que envolve 'Ca IND.2' 'MAIS', troponina (Tn), actina (Ac) e miosina. A Tm é uma proteína flexível, de estrutura "coiled-coil", constituída de duas 'alfa'-hélices com 284 aminoácidos cada uma. A molécula de Tm faz interações do tipo "cabeça-cauda" com outra molécula de Tm através da sobreposição de aproximadamente 8 a 15 resíduos da extremidade N-terminal de uma molécula com 8 a 15 resíduos da extremidade C-terminal da outra molécula de Tm. Desta maneira, em baixas forças iônicas, formam-se filamentos lineares através de um processo de polimerização. A estabilidade de regiões específicas da Tm pode ser importante para a sua função no controle da regulação da contração muscular. Além disso, a Tm pode ser usada como um modelo relativamente simples e de ocorrência natural para entendermos as interações intra- e intermoleculares que governam a estabilidade das "coiled-coils". Assim sendo, nós produzimos oito fragmentos recombinantes de Tm ('Tm IND.143-284(50HW)', 'Tm IND.189-284(50HW)', 'Tm IND.189-284', 'Tm IND.22G-284(50HW)', 'Tm IND.220-284', 'Tm IND.143-235', 'Tm IND.167-260' e 'Tm IND.143-260)' e um peptídeo sintético (Ac-'Tm IND.215-235)' com a finalidade de investigar as estabilidades conformacionais relativas das diferentes regiões derivadas da metade C-terminal da proteína, a qual é conhecida por suainteração com o complexo troponina. Experimentos de ultracentrifugação analítica mostram que os fragmentos que incluem os últimos 24 resíduos da molécula '(Tm IND.43-284(50HW), 'Tm IND.189-284(50HW)', 'Tm IND.22G-284(50HW)', 'Tm IND.220-284)' estão completamente dimerizados a 10 'MICROMOL' (concentração do dímero em 50 'MILIMOL' de tampão fosfato, pH 7,0; 100 'MILIMOL' de NaCI; 0,5 'MILIMOL' de DTT e 0,5 'MILIMOL' de EDTA, 10 'GRAUS CELSUS.'), enquanto que fragmentos ) que não possuem o C-terminal nativo '(Tm IND.143-235', 'Tm IND.167-260' e 'Tm IND.143-260)' se encontram em equilíbrio monômero-dímero nestas condições. A presença de trifluoroetanol promove uma diminuição na razão ['TETA']222/['TETA']208, observada por dicroísmo circular, em todos os fragmentos e induz a formação de trímeros estáveis apenas para aqueles contendo os resíduos 261-284. Estudos de desnaturação por uréia, acompanhados por dicroísmo circular e fluorescência, mostram que os resíduos 261-284 da tropomiosina são muito importantes para estabilidade da metade C-terminal da molécula. Além do mais, a ausência desta região promove um aumento na cooperatividade do desenovelamento induzido por uréia. Os experimentos de desnaturação por temperatura e por uréia mostram que o fragmento 'Tm IND.143-235', é relativamente instável quando comparado com outros fragmentos de mesmo tamanho. Nós identificamos alguns fatores que podem estar contribuindo para a particular instabilidade desta região,incluindo repulsões inter-hélices entre resíduos em posições g e e' da repetição heptapeptídica, um resíduo carregado na interface hidrofóbica da "coiled-coil" e por fim, uma grande fração de resíduos 'BETA'-ramificados localizados em posições d. Sabe-se que a não acetilação do N-terminal da molécula de Tm, bem como a ausência de alguns resíduos na sua extremidade C-terminal, fazem com que a Tm deixe de sofrer polimerização. Entretanto, trabalhos anteriores realizados em nosso laboratório haviam mostrado que um fragmento de Tm recombinante (ASTm1-260), contendo a fusão dipeptídica Ala-Ser (que é conhecida por restaurar a capacidade de polimerização de Tm não acetiladas no N-terminal), polimerizava-se mais do que a proteína recombinante de tamanho integral (ASTm), apesar da deleção dos últimos 24 aminoácidos C-terminais. Para investigar com mais detalhes a natureza da interação cabeça-cauda, nós construímos ) dois fragmentos que compreendem a metade N-terminal da molécula de Tm, 'ASTm IND.1-142' e 'nfTm IND.1-142', o primeiro deles contendo uma fusão dipeptídica AS no N-terminal e o segundo com o N-terminal não acetilado, sem a fusão dipeptídica. Estes dois fragmentos foram empregados em ensaios de interação cabeça-cauda, realizados através de ensaios de desnaturação térmica acompanhados por dicroísmo circular, juntamente com três fragmentos da região C-terminal da Tm. Dois dos fragmentos C-terminais acabam na posição 260 ('Tm IND.167-260' e 'TmIND.143-260)' e um deles termina na posição 284 '(Tm IND.220-284)', que corresponde ao C-terminal nativo da proteína. Os resultados mostram que ocorre uma interação cabeça-cauda entre o fragmento N-terminal 'ASTm IND.1-142' e todos os fragmentos C-terminais utilizados neste estudo. As moléculas recombinantes de Tm que terminam na posição 260 são, de fato, capazes de fazer interações cabeça-cauda independentemente do fato de elas se apresentarem instáveis nas condições estudadas. Inclusive, após a interação, ocorre um aumento considerável na estrutura 'alfa'-hélice, o que se dá preferencialmente nos fragmentos C-terminais
- Imprenta:
- Data da defesa: 03.10.2003
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ABNT
PAULUCCI, Adriana Aparecida. Fragmentos de tropomiosina-estudos da estabilidade conformacional e da interação cabeça-cauda. 2003. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo, São Paulo, 2003. Disponível em: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-23042018-114148/. Acesso em: 06 maio 2024. -
APA
Paulucci, A. A. (2003). Fragmentos de tropomiosina-estudos da estabilidade conformacional e da interação cabeça-cauda (Tese (Doutorado). Universidade de São Paulo, São Paulo. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-23042018-114148/ -
NLM
Paulucci AA. Fragmentos de tropomiosina-estudos da estabilidade conformacional e da interação cabeça-cauda [Internet]. 2003 ;[citado 2024 maio 06 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-23042018-114148/ -
Vancouver
Paulucci AA. Fragmentos de tropomiosina-estudos da estabilidade conformacional e da interação cabeça-cauda [Internet]. 2003 ;[citado 2024 maio 06 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-23042018-114148/
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