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Caracterização bioquímica das ß-glucosidases do scytalidium thermophilum (2005)

  • Authors:
  • USP affiliated authors: ZANOELO, FABIANA FONSECA - FFCLRP
  • USP Schools: FFCLRP
  • Sigla do Departamento: 592
  • Subjects: BIOQUÍMICA MICROBIANA
  • Language: Português
  • Abstract: A celulose é a mais abundante fonte de carbono presente na madeira e nos resíduos agrícolas. Na natureza a hidrólise completa da celulose é realizada pela ação sinergística de diferentes enzimas, como: as endo-1,4-'beta'-D-glucanase, exo-1,4-'beta'- glucanase e 'beta'-glucosidase ou celobiase. O presente trabalho descreve algumas propriedades fisiológicas e bioquímicas do sistema 'beta'-glucosidásico do Scytalidium thermophilum, um fungo celulolítico termofílico isolado do solo da Índia, que nos foi gentilmente cedido pelo Dr. G. Straastma (Mushroom Experimentall Station, Holanda). As condições de cultivo que favoreceram a produção e excreção das 'beta'-glucosidases foram determinadas. Entre os açúcares testados como fonte de carbono, avicel e celobiose foram os melhores indutores das 'beta'-glucosidases extracelular e micelial.. Experimentos com culturas "jovens" sugeriram que a produção da atividade 'beta'- glucosidase foi regulada por repressão catabólica e indução por substrato. A adição de ciclo-heximida inibiu a síntese da 'beta'-glucosidase, sugerindo que a enzima produzida na presença de celobiose ou avicel é resultado da síntese "de novo" das proteínas. Filtrados das culturas de S. thermophilum crescidos em avicel ou celobiose como fonte de carbono produziram dois picos com atividade de 'beta'-glucosidase quando analisado em coluna de troca iônica DEAE-celulose. O Pico I ('beta'-glucosidase I) foi purificado utilizando-se um fracionamento protéico, ecolunas de troca-iônica DEAE-celulose e CM-celulose. A 'beta'-glucosidase I foi purificada 2.4 vezes com 2.0% de recuperação. A 'beta'-glucosidase micelial foi purificada utilizando-se um choque térmico, fracionamento protéico, coluna de filtração Sephadex G-100 e uma coluna troca-iônica DEAE-celulose. Foi purificada 23 vezes com recuperação de 25%. Ambas enzimas purificadas são proteínas monoméricas. A 'beta'-glucosidase I exibiu uma massa molecular ... de 41kda (SDS-PAGE) e 38kDa (coluna de filtração). A 'beta'-glucosidase micelial apresentou uma massa molecular de 57kDa em SDS-PAGE e 38kDa em coluna de filtração. Ambas enzimas são glicoproteínas com conteúdos de carboidrato de 65% e 15% para a 'beta'-glucosidase I e micelial, respectivamente. A 'beta'-glucosidase I exibiu um ponto isoelétrico de 4.0, enquanto que a 'beta'-glucosidase micelial o ponto isoelétrico foi de 6.5. Os valores de temperatura e pH foram de 70 e 60'graus'C e de 5.5 e 6.0 para a 'beta'-glucosidase I e micelial, respectivamente. A enzima micelial foi estável por até 60 minutos a 50'graus'C em tampão McIlvaine pH 6.5, e exibiu uma meia vida de 13 minutos a 70'graus'C. A 'beta'-glucosidase I hidrolizou p-nitrofenil-'beta'-D-glucopiranosídeo (PNP-glu), p-nitrofenil-'beta'-D-xilopiranosídeo (PNP-xil), celobiose, xiIana e CM-celulose, enquanto que a 'beta'-glucosidase micelial hidrolisou PNP-glu, p-nitrofenil-'beta'-D-fucopiranosídeo (PNP-fuc),PNP-xil, p-nitrofenil-'beta'-D- galactopiranosídeo (PNP-gal), o-nitrofenil-'beta'-D-galactopiranosídeo (ONPG) e lactose. Ambas enzimas purificadas foram ativadas por glicerol 1M. 'Beta'-glucosidase I foi tolerante a glicose 50mM e ativada por xilose, frutose e lactose. Glicose numa concentração acima de 50mM inibiu a 'beta'-glucosidase I, e exibiu um 'K IND. i' (constante de inibição aparente) para este carboidrato de 71mM. A enzima micelial foi ativada por glicose e xilose., exibindo um 'k IND. 0,5' de 37mM e 43mM, respectivamente. A mistura de xilose e glicose não exibiu efeito aditivo na atividade enzimática, sugerindo que xilose e glicose tenham o mesmo sítio catalítico na 'beta'-glucosidase micelial. Os valores de Km e Vmáx para a 'beta'-glucosidase extracelular I foram de 4,33 e 0,342mM e de 5,37 e 2,0'mü'moles/min/mg prato para celobiose e PNP-glu, respectivamente. Os valores de Km e Vmáx para 'beta'-glucosidase micelial foram ... de 0,29mM e 13,27'mü'moles/min/mg prot; 0,5 mM e 7,25'mü'moles/min/mg prot e 1,61 mM e 4,12'mü'moles/min/mg prot para os substratos PNP-glu, PNP-fuc e celobiose, respectivamente. A presença de glicose e xilose nos meios de reação contendo PNP-glu como substrato, aumenta valores de Km e Vmáx da 'beta'-glucosidase micelial. A hidrólise do PNP-glu pela 'beta'-glucosidase micelial foi inibida por celobiose, com um 'K IND. i' de 1,32mM, sugerindo que ambos substratos, natural e sintético são hidrolisados no mesmosítio catalítico. Análise em cromatografia delgada de sílica demonstraram que as enzimas, 'beta'-glucosidase I e micelial, hidrolisam celobiose em baixas concentrações (10mM) e polimerizam celooligossacarideos em altas concentrações de celobiose (250mM), exibindo atividade de transglicosilação. As diferentes propriedades observadas entre a da 'beta'-glucosidase micelial e extracelular de S. thermophilum sugerem que as enzimas são diferentes. A estabilidade térmica, o efeito positivo da glicose e xilose para a 'beta'-glucosidase micelial, ou xilose para a da 'beta'-glucosidase extracelular são certamente propriedades que distinguem essas enzimas de outras da 'beta'-glucosidases descritas na literatura
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 24.03.2005
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    FCLRP20800019198Zanoelo, Fabiana Fonseca
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    • ABNT

      ZANOELO, Fabiana Fonseca; JORGE, João Atílio. Caracterização bioquímica das ß-glucosidases do scytalidium thermophilum. 2005.Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2005. Disponível em: < http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/59/59139/tde-05072007-161456/?&lang=pt-br >.
    • APA

      Zanoelo, F. F., & Jorge, J. A. (2005). Caracterização bioquímica das ß-glucosidases do scytalidium thermophilum. Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/59/59139/tde-05072007-161456/?&lang=pt-br
    • NLM

      Zanoelo FF, Jorge JA. Caracterização bioquímica das ß-glucosidases do scytalidium thermophilum [Internet]. 2005 ;Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/59/59139/tde-05072007-161456/?&lang=pt-br
    • Vancouver

      Zanoelo FF, Jorge JA. Caracterização bioquímica das ß-glucosidases do scytalidium thermophilum [Internet]. 2005 ;Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/59/59139/tde-05072007-161456/?&lang=pt-br

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