Purificação e caracterização bioquímica da 'alfa'-glucosidase com ação de transglicosilação produzida pelo fungo termotolerante Aspergillus phoenicis (2009)
- Authors:
- Autor USP: BENASSI, VIVIAN MACHADO - FMRP
- Unidade: FMRP
- Sigla do Departamento: RBI
- Subjects: ASPERGILLUS; ENZIMAS AMILOLÍTICAS; BIOTECNOLOGIA
- Language: Português
- Abstract: Algumas espécies de Aspergillus são excelentes produtoras de enzimas de aplicação industrial, tais como, as amilases. A utilização industrial de enzimas amilolíticas exige uma produção em larga escala, máxima atividade e um profundo conhecimento das suas propriedades intrínsecas e aspectos estruturais. Neste contexto, nós padronizamos as condições para o cultivo adequado do fungo filamentoso Aspergillus phoenicis, purificamos uma 'alfa'-glucosidase e caracterizamos os parâmetros físico-químicos desta enzima. O fungo foi cultivado em meio Khanna com modificações nas soluções de sais, suplementado com maltose ou farinha de mandioca 1%, pH inicial 6,0, à 30°C sob condição estática, durante quatro dias. Para purificação enzimática, utilizou-se dos procedimentos: tratamento da amostra extracelular bruta com caulin, seguida de eluição em colunas cromatográficas de troca iônica DEAE-Fractogel e filtração em Biogel P100. A 'alfa'-glucosidase purificada a partir de meio de cultura suplementado com maltose é uma glicoproteina com 20% de carboidrato, massa molecular de 100 kDa (SDS-PAGE) ou 95 kDa (Superdex 75 - Pharmacia) e ponto isoelétrico 3,12. A 'alfa'-glucosidase purificada a partir do meio de cultura suplementado com farinha de mandioca é também uma glucoproteina com 18,52% de carboidrato, massa molecular de 83 kDa (SDS-PAGE) ou 80 kDa (Superdex 75 - Pharmacia) e ponto isoelétrico 3,0. Análises de Dicroísmo Circular mostraram que a enzima puraproduzida no meio de cultura suplementado com maltose apresentou estrutura secundária rica em 'alfa'-hélice. O caráter amilolítico foi definido como sendo de uma 'alfa'-glucosidase tipo III baseando-se na análise dos produtos de hidrólise formados em TLC, quando ambas as enzimas atuaram sobre amido e maltose como substratos. Os produtos formados foram apenas glucose quando o substrato foi amido, e glucose e maltooligossacarídeos (maltotriose e maltetraose) a partir de maltose indicando atividade de transglicosilação. Além disso, constatou-se que as enzimas purificadas hidrolisaram eficientemente diferentes tipos de amidos, glicogênio e amilopectina (componentes ramificados) e dissacarídeos como a sacarose, maltose e substratos sintéticos como o p-nitrofenil-'alfa'-D-glucopiranosídeo. Aparentemente, ambas as enzimas possuem sítios ativos distintos para os substratos sacarose e amido. Verificou-se uma V 'V IND. máx.'. de 560U/mg de proteína e 527U/mg de proteína e K 'K IND. M' 1,42mg/mL e 6,38mg/mL para as 'alfa'-glucosidases puras produzidas em maltose e farinha de mandioca, respectivamente, ao utilizar substrato amido, e V 'V IND. máx.' de 32,9 U/mg de proteína e 9,2 U/mg de proteína e K 'K IND. M' 0,96mg/mL e 0,76mg/mL para o substrato maltose. As 'alfa'-glucosidases obtidas em meio com maltose ou farinha de mandioca possuíram temperaturas ótimas na faixa de 60°C-65°C, pHs ótimos de 4,5-5,5, termoestabilidade até 60°C e foram estáveis ao pH(faixa de 3,0 a 6,5). Em relação à ativação e/ou inibição por íons e outros compostos, diferenças foram observadas para as enzimas produzidas nas distintas fontes de carbono, assim como em relação às enzimas brutas e purificadas. Destacou-se o aumento significativo das atividades enzimáticas na presença de Mn 'Mn POT. 2+', exceto para a enzima bruta produzida com farinha de mandioca. Neste trabalho, nós também analisamos a produção amilolítica com diferentes fontes de carbono utilizadas em indústrias alimentícias. Observaram-se excelentes níveis enzimáticos extracelulares quando os meios foram suplementados com flocos de centeio, farinha de mandioca, flocos de aveia, amido e maltose, entre outros. O complexo amilolítico formado nestas condições hidrolisaram eficientemente os substratos usados como indutores, formando níveis relativamente altos de açúcares redutores. Conclui-se que A. phoenicis possui um promissor potencial biotecnológico, uma vez que trata-se de um fungo termotolerante que possui muitas características adequadas para a tecnologia básica de amilases. Além do mais, estas enzimas são produzidas sobre fontes de carbono pouco onerosas e possuem ação de transglicosilação
- Imprenta:
- Publisher place: Ribeirão Preto
- Date published: 2009
- Data da defesa: 24.04.2009
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ABNT
BENASSI, Vivian Machado. Purificação e caracterização bioquímica da 'alfa'-glucosidase com ação de transglicosilação produzida pelo fungo termotolerante Aspergillus phoenicis. 2009. Dissertação (Mestrado) – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2009. . Acesso em: 13 maio 2024. -
APA
Benassi, V. M. (2009). Purificação e caracterização bioquímica da 'alfa'-glucosidase com ação de transglicosilação produzida pelo fungo termotolerante Aspergillus phoenicis (Dissertação (Mestrado). Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. -
NLM
Benassi VM. Purificação e caracterização bioquímica da 'alfa'-glucosidase com ação de transglicosilação produzida pelo fungo termotolerante Aspergillus phoenicis. 2009 ;[citado 2024 maio 13 ] -
Vancouver
Benassi VM. Purificação e caracterização bioquímica da 'alfa'-glucosidase com ação de transglicosilação produzida pelo fungo termotolerante Aspergillus phoenicis. 2009 ;[citado 2024 maio 13 ]
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