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Labaditina e seus análogos modificados: estudos estruturais, conformacionais e interações com membranas (2009)

  • Authors:
  • USP affiliated authors: BARBOSA, SIMONE CRISTINA - FFCLRP
  • USP Schools: FFCLRP
  • Subjects: PEPTÍDEOS; LIPOSSOMOS; SÍNTESE QUÍMICA
  • Language: Português
  • Abstract: Labaditina é um decapeptídeo cíclico, encontrado em uma planta superior, com elevado caráter hidrofóbico e tem em sua estrutura dois resíduos de triptofano. Este peptídeo tem ganhado grande interesse biológico e farmacológico diante de algumas propriedades, tais como a inibição sobre a ativação da via clássica do sistema complementar humano e poder inibitório da acetilcolinesterase. Entretanto, até o presente momento não é conhecido o alvo nem seu mecanismo de ação. Assim, através da técnica síntese em fase sólida, o peptídeo Labaditina (Lo) e cinco análogos lineares foram obtidos com o objetivo de avaliar tanto a importância da estrutura cíclica bem como o grau de interação do peptídeo com membrana sintética e natural. Assim, o peptídeo 'L IND. 1' foi planejado como análogo linear da Labaditina (Lo), aberta na posição de uma glicina. Os demais peptídeos ('L IND. 2' a 'L ind. 5') foram planejados trocando um dos triptofanos por leucina, alternadamente. O peptídeo 'L IND. 1' (análogo linear da Labaditina) foi ciclizado para obtenção do Lo. Os peptídeos foram purificados por CLAE e analisados por espectrometria de massas com pureza acima de 95%. Inicialmente foi analisada a atividade hemolítica dos diferentes peptídeos empregando-se hemácias como modelo de membrana natural e observou-se que os peptídeos obtiveram baixo índice de hemólise, com valores menores que 8% de liberação de hemoglobina, exceto para o peptídeo 'L IND. 4' que liberou cerca de 18% naconcentração de 10 µg/mL. Com relação a efeitos citotóxicos, apenas o peptídeo Lo apresentou redução da viabilidade para Streptococcus mutans (redução de 25% na presença de 5 µM e 56% com 100 µM). Já para bactéria Gram negativa não foi observada citotoxicidade nem para Lo ou 'L IND. 1' na faixa de concentração de até 100 µM. Em seguida foi avaliada a interação dos peptídeos com sistemas de lipossomos constituídos de DPPC através de diferentes técnicas, tais como espalhamento de luz, fluorescência, dicroísmo circular (CD). Na primeira abordagem foi avaliada a mudança do diâmetro dos lipossomos e foi observado que os peptídeos Lo e 'L IND. 1' causaram maior perturbação no sistema, aumentando o diâmetro médio dos lipossomos em cerca de 2 vezes quando comparados aos outros peptídeos. Este efeito pode ser correlacionado à agregação e/ou fusão dos sistemas vesiculares conforme o aumento da concentração do peptídeo em solução. Estes estudos de hemólise e monitoramento do diâmetro dos lipossomos sugeriram que os peptídeos Lo e 'L ind. 1' tem efeito de interface com sistemas de lipídeos, não causando hemólise, por isso os demais estudos foram realizados comparativamente apenas com a forma linear ('L IND. 1') e a cíclica (Lo). Estudos de f1uorescência revelaram que Lo ou 'L ind. 1' interagem com lipossomos. Conforme o aumento da concentração do peptídeo é- observado um decaimento da intensidade de t1uorescência do triptofano. Também foi observadoum deslocamento para menores valores de Âmax de emissão, embora tenha sido maior para Lo. Essa redução do Àrnáx é atribuída à migração do triptofano para um ambiente mais apolar. Assim, através da supressão de fluorescência foram determinadas as constantes de Stem-Volmer (Ksv): para Lo= 13,72 e 'L IND. 1'= 8,48 'M POT. -1' na ausência e 2,02 e 4,76 'M POT. -1' na presença de lipossomos, respectivamente. Assim, o Lo apresentou menor supressão (valores menores de Ksv) resultando em uma maior interação com os lipossomos. As mudanças conformacionais dos peptídeos foram estudadas por CD e, também, foram feitas simulações por dinâmica molecular (DM). Além disso, foi feito um estudo termodinâmico por calorimetria diferencial (DSC). Os estudos de CD foram realizados em diferentes ambientais, tais como: solventes; pH; temperatura; diferentes concentrações de peptídeo, de guanidina ou de TFE; ou ainda na presença de lipossomos. O peptídeo Lo em meio aquoso ou na presença de lipossomos apresenta uma banda negativa (207 nm) e outra positiva (190 nm) sugerindo que o peptídeo está predominantemente desestruturado nestas condições. Também foi observado um aumento da elipticidade conforme o aumento da concentração do peptídeo, possivelmente devido à saturação dos peptídeos na camada lipídica. Já o espectro de CD do peptídeo 'L IND. 1' em meio aquoso, é característico de estrutura ao acaso (random coil), uma banda negativa (197 nm) e outra positiva (224 nm).Quando ocorre a interação dos peptídeos com lipossomos é observado um pequeno deslocamento da banda negativa, passando de 197 para 195 nm, e também o desaparecimento da banda positiva 224 nm. Isso se deve, provavelmente, a interação do peptídeo com a camada lipídica, o que resultou no distanciamento dos triptofanos. Pela técnica de DSC foi observado que a adição de quantidades crescentes de peptídeo Lo nos lipossomos não induz novas transições de fase. No entanto foi observado um deslocamento da temperatura de pré-transição (31,7 para 33,8°C) e da de transição principal (41,0 para 41,4°C), embora isso não tenha sido tão expressivo na transição principal, quando se compara na ausência e presença de 50 µM do peptídeo. Já para o peptídeo 'L IND. 1' também foi observado um deslocamento da pré-transição (31,7 para r 33,I°C) e da temperatura de transição principal (41,0 para 41,3°C), quando se compara na ausência e presença de 50 µM do peptídeo. Observou-se uma maior variação da entalpia ('delta'H) para o peptídeo Lo do que para o peptídeo 'L IND. 1', variando de 50,8 para Lo e 18,2 Kcal/mo1 para'L IND. 1', sugerindo uma maior inserção de Lo do que'L IND. 1'. Assim, pode ser sugerido que tanto Lo quanto 'L IND. 1'induzem, primeiramente, um efeito de empacotamento do DPPC na superfície dos lipossomos, que é um resultado da inserção do peptídeo na membrana que ocorre com o aumento das concentrações dos peptídeos. Na estrutura do peptídeo Loobtido por DM observa-se que os resíduos de triptofano estão distantes, não sofrem interação, já para o peptídeo'L IND. 1', é possível visualizar uma grande aproximação destes resíduos. E este comportamento pode ser confirmado pelos espectros de CD. Assim, um provável mecanismo de interação da Labaditina, é baseado inicialmente na interação hidrofóbica do peptídeo com a membrana lipídica. Em seguida ocorre a adsorção do peptídeo na superfície lipídica onde os peptídeos estão diretamente em contato. Em seguida, no terceiro passo, ocorre o processo de intermatização com conseqüente mudança conformacional do peptídeo. Esse mecanismo pode ser confirmado através de fluorescência onde observamos, inicialmente, uma discreta redução do 'lâmbida'máx de emissão seguida por um patamar constante, conforme o aumento da relação peptídeo/lipídeo, onde ocorre a adsorção na membrana. Após este patamar é observada uma nova redução nos valores de 'lâmbida'máx de emissão, atingindo um novo patamar em 339 nm, período de inserção
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 17.09.2009

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    BibliotecaCód. de barrasNúm. de chamada
    FCLRP20800030372Barbosa, Simone Cristina
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    • ABNT

      BARBOSA, Simone Cristina; CIANCAGLINI, Pietro. Labaditina e seus análogos modificados: estudos estruturais, conformacionais e interações com membranas. 2009.Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2009.
    • APA

      Barbosa, S. C., & Ciancaglini, P. (2009). Labaditina e seus análogos modificados: estudos estruturais, conformacionais e interações com membranas. Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto.
    • NLM

      Barbosa SC, Ciancaglini P. Labaditina e seus análogos modificados: estudos estruturais, conformacionais e interações com membranas. 2009 ;
    • Vancouver

      Barbosa SC, Ciancaglini P. Labaditina e seus análogos modificados: estudos estruturais, conformacionais e interações com membranas. 2009 ;