Construção de um novo sistema de expressão e purificação de proteínas recombinantes baseada em esporos de Bacillus subtilis (2009)
- Authors:
- USP affiliated authors: FERREIRA, RITA DE CASSIA CAFE - ICB ; FERREIRA, LUIS CARLOS DE SOUZA - ICB
- Unidade: ICB
- Assunto: MICROBIOLOGIA
- Language: Português
- Abstract: A maioria de proteínas de relevância biomédica é encontrada em baixas quantidades em suas fontes naturais. A expressão de genes heterólogos em bactérias é a forma mais simples e barata de se obter grandes quantidades de polipeptídeos almejados tanto para a pesquisa quanto para a indústria. Os maiores problemas associados à produção de proteínas recombinantes é o re-estruturamento da proteína e a perda da atividade biológica. Assim sendo, o objetivo deste trabalho foi construir um sistema de expressão baseado em esporos de Bacillus subtilis que permita a purificação de proteínas heterólogas que apresentam tendência a formar corpos de inclusão ou falta de atividade quando super expressas em Escherichia coli. Inicialmente clonamos a região N-terminal e o promotor da proteína CotB, proteína comum e de alto número na capa do esporo, em um vetor integrativo de B. subtilis, fusionada à proteína carreadora foi clonada uma mini-inteína, proteína com atividade de auto-clivagem em baixas temperaturas e pH, que permite a purificação da proteína alvo e, em seguida o gene repórter da ?-amilase foi clonado em frame com a CotB::Inteína. O vetor foi integrado a uma região não essencial do B. subtilis e os esporos recombinantes foram avaliados quanto a expressão da ?-amilase por meio da degradação do amido em placa e em solução. A purificação da ?-amilase foi mediada pela ativação da mini-inteína após incubação dos esporos em tampão por 16 horas a 25º C. Como resultado,construímos o vetor integrativo pMTB122 e o transformamos na linhagem 1012 de B. subtilis. Em seguida, observamos que a ?-amilase ligada ao esporo foi capaz de degradar o amido tanto em placa quanto em solução de forma eficiente. ) Por fim, a ?-amilase foi purificada da superfície do esporo com a ativação da mini-inteína e separada dos esporos por centrifugação, o sobrenadante com a ?-amilase purificada foi capaz de degradar aproximadamente 90 % do amido em solução. Conforme exposto, o novo sistema foi gerado com sucesso e permitiu a expressão de proteína com atividade biológica tanto na superfície do esporo como livre (após purificação). Além disso, pela primeira vez este tipo de purificação rápida e fácil foi realizada em esporos e se mostrou extremamente eficiente, abrindo novas perspectivas para proteínas que apresentam problemas de expressão nos sistemas convencionais.
- Imprenta:
- Publisher: Sociedade Brasileira de Microbiologia
- Publisher place: Porto de Galinhas
- Date published: 2009
- Source:
- Título do periódico: Resumos
- Conference titles: Congresso Brasileiro de Microbiologia
-
ABNT
TAVARES, M. B. et al. Construção de um novo sistema de expressão e purificação de proteínas recombinantes baseada em esporos de Bacillus subtilis. 2009, Anais.. Porto de Galinhas: Sociedade Brasileira de Microbiologia, 2009. . Acesso em: 24 abr. 2024. -
APA
Tavares, M. B., Nguyen, Q. A., Luiz, W. B., Paccez, J. D., Schumann, W., Ferreira, L. C. de S., & Ferreira, R. de C. C. (2009). Construção de um novo sistema de expressão e purificação de proteínas recombinantes baseada em esporos de Bacillus subtilis. In Resumos. Porto de Galinhas: Sociedade Brasileira de Microbiologia. -
NLM
Tavares MB, Nguyen QA, Luiz WB, Paccez JD, Schumann W, Ferreira LC de S, Ferreira R de CC. Construção de um novo sistema de expressão e purificação de proteínas recombinantes baseada em esporos de Bacillus subtilis. Resumos. 2009 ;[citado 2024 abr. 24 ] -
Vancouver
Tavares MB, Nguyen QA, Luiz WB, Paccez JD, Schumann W, Ferreira LC de S, Ferreira R de CC. Construção de um novo sistema de expressão e purificação de proteínas recombinantes baseada em esporos de Bacillus subtilis. Resumos. 2009 ;[citado 2024 abr. 24 ] - Bacillus subtilis endospores at high purity and recovery yields: optimization of growth conditions and purification method
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