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Desenvolvimento e caracterização de uma enzima quimérica bifuncional xilanase-lacase através de desenho racional (2009)

  • Authors:
  • USP affiliated authors: RIBEIRO, LUCAS FERREIRA - FMRP
  • USP Schools: FMRP
  • Subjects: ENZIMAS; BIOTECNOLOGIA; PROTEÍNAS; BIOQUÍMICA
  • Language: Português
  • Abstract: Existem evidências de que xilana e resíduos fenólicos de lignina estejam unidos por ligações covalentes (Ferre ira Filho, 1994). A degradação destes polímeros consiste, geralmente, em um processo multienzimático e sinérgico, o que pode ser obtido pela ação coordenada de uma série de enzimas do grupo das oxidoredutases e hidrolases, representadas principalmente pelas lacases (EC 1.10.3.2) e xilanases (EC 3.2.1.8), respectivamente(You, Meng et ai., 2008; Cristina Valls e Roncero, 2009). Neste contexto, o presente trabalho visou à construção de uma enzima bifuncional, que tenha tanto atividade xilanásica, quanto atividade lacásica, buscando, desta forma, criar uma nova enzima com uma atuação mais abrangente para tais processos biotecnológicos, além de fornecer importantes ferramentas para compreensão das relações de estrutura-função destas proteínas. Para estas finalidades, foi criado um modelo da enzima bifuncional, via modelagem molecular, onde foi feito um desenho racional visando à máxima estabilidade conformacional ! das enzimas em questão. Após isto, o DNA genômico de Bacillus subtilis foi extraído e usado : como molde para a amplificação dos genes cotA, que codifica a enzima lacase (CotA, 65 kDa) e xynA, que codifica a endo -ß-1,4 xilanase A (XynA, 21.2 kDa). Tal amplificação foi feita através da reação em cadeia da polimerase (PCR) e os resultados obtidos, foram como esperados. Posteriormente, os genes foram clonados no vetor pT7T3 18U, usandosítios de HindIII e BamHI e subclonados no vetor de expressão pET28a (+), usando sítios de NheI e BamHI. Os genes cotA e xynA foram expressos, de forma heteróloga, em Escherichia coli. A purificação da lacase e da endo ß-1,4 xilanase A foi realizada através de cromatografia por afinidade, pela interação entre a cauda de poli-histidina (inserida nas proteínas por sua expressão em pET28a (+) e a resina NTA-Ni. Após a purificação, um ensaio de atividade enzimática foi realizado, o que demonstrou a funcionalidade das enzimas em questão. A fusão gênica foi realizada através de técnicas de engenharia genética, utilizando como DNA molde as enzimas clonadas em pT7T3 18U, os oligonucleotídeos (primers) específicos e as enzimas de restrição necessárias a este fim. O resultado da fusão, o gene quimera, foi clonado em pT7T3 18U e subclonado em pET28a (+), este foi expresso e . purificado de maneira semelhante às enzimas separadas. O resultado da purificação da enzima hibrida foi confirmado por SDS-P AGE. Uma amostra do gene quimera clonado em pET28a (+) (pET28a/cotA-xynA) teve sua xilanase retirada, por enzimas de restrição, e substituída por uma variante termofilica da xilanase (xilanase G3), dando origem a uma nova construção. Após a expressão e purificação da enzima bifuncional, foram feitos ensaios de caracterização cinética, que demonstraram que para a atividade lacásica, o pH de máxima atividade foi 4,5 para ambas as enzimas, a temperatura foi 80°Cpara a lacase parental e 75°C para a quimera. A enzima bifuncional apresentou uma eficiência catalítica (Kcat/'K IND.0,5) aproximadamente duas vezes maior que a lacase sozinha (345,6 'mM POT.-1 'S POT.-1' para a fusão e 166,7 'mMPOT.-1 'S POT.-1' para a lacase). Para atividade xilanásica a pH de máxima atividade foi 6,5 para xilanase nativa e sua quimera equivalente e 7,0 para a xilanase mutante (G3) e quimera com xilanase mutante. A temperatura foi 55°C para as atividades referentes à xilanase nativa e 70 °C para às mutantes. Os parâmetros cinéticos medidos para as atividades xilanásicas demonstraram que não houve diferenças consideráveis entre as xilanases parentais e as fusões equivalentes. Sendo assim, nossos resultados demonstraram que a abordagem feita no presente trabalho mostrou-se eficiente para a construção de enzimas hibridas ou multifuncionais
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 21.09.2009

  • Exemplares físicos disponíveis nas Bibliotecas da USP
    BibliotecaCód. de barrasNúm. de chamada
    FMRP11200038072Ribeiro, Lucas Ferreira
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    • ABNT

      RIBEIRO, Lucas Ferreira; WARD, Richard John. Desenvolvimento e caracterização de uma enzima quimérica bifuncional xilanase-lacase através de desenho racional. 2009.Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2009.
    • APA

      Ribeiro, L. F., & Ward, R. J. (2009). Desenvolvimento e caracterização de uma enzima quimérica bifuncional xilanase-lacase através de desenho racional. Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto.
    • NLM

      Ribeiro LF, Ward RJ. Desenvolvimento e caracterização de uma enzima quimérica bifuncional xilanase-lacase através de desenho racional. 2009 ;
    • Vancouver

      Ribeiro LF, Ward RJ. Desenvolvimento e caracterização de uma enzima quimérica bifuncional xilanase-lacase através de desenho racional. 2009 ;

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