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Retina de aves como sistema circadiano e sua modulação por luz e glutamato (2009)

  • Authors:
  • USP affiliated authors: LIMA, LEONARDO HENRIQUE RIBEIRO GRACIANI DE - IB
  • USP Schools: IB
  • Subjects: AVES; RETINA; RITMO CIRCADIANO; FOTOPERIODISMO
  • Language: Português
  • Abstract: O sistema circadiano das aves é composto pela retina, a região homóloga aos núcleos supraquiasmáticos de mamíferos (NSQ) e a glândula pineal. A retina apresenta muitos eventos fisiológicos rítmicos, como por exemplo os movimentos das células fotorreceptoras em vertebrados não mamíferos, a expressão de opsinas, regeneração do cromóforo visual e produção e liberação de melatonina e dopamina. Todos estes eventos rítmicos são coordenados para prever alterações nas condições luminosas que ocorrem durante o dia, otimizando a função retiniana. Neste trabalho foi investigada a expressão de componentes chave de um sistema circadiano, incluindo os dois genes de melanopsina, Opn4x e Opn4m, os genes de relógio Clock e Per2, e os genes das enzimas chave da síntese de melatonina, N-Acetiltransferase, e de dopamina, Tirosina Hidroxilase, em células da retina de embriões de galinha. Culturas primárias de retina de embriões de galinha com 8 dias foram preparadas no ZT0 (quando as luz é acesa) e semeadas na densidade de 107 células por frasco de 25 cm2 . As células foram mantidas em ambiente úmido, com 5% CO2, a 40o C, em escuro constante, fotoperíodo 12C:12E, fotoperíodo 12C:12E seguido de escuro constante, ou em escuro constante na presença e na ausência de glutamato 100 μM por 12 h. A extração de RNA total foi feita ao longo de 24 horas com intervalo de três horas tendo início no ZT0 do sexto dia. As amostras foram submetidas a RT-PCR seguido de PCR quantitativo para aquantificação de RNAm. Para confirmar a expressão da proteína OPN4x foi realizado ensaio imunohistoquímico com anticorpos anti-melanopsina de galinha desenvolvidos em coelho. Também foi feita a quantificação da concentração das proteínas OPN4x, CLOCK e TIROSINA HIDROXILASE através da técnica de Western Blot. A quantificação do RNAm em escuro constante não apresentou ritmos de transcrição para nenhum gene. Já ) as células mantidas em fotoperíodo 12C:12E apresentaram padrões rítmicos de transcrição para Clock, Per2, Opn4m, N-Acetiltransferase e Tirosina Hidroxilase. Glutamato 100 μM foi eficaz em induzir ritmo em Clock, e inibiu drasticamente a expressão de Tirosina Hidroxilase e, apenas mais pontualmente, de Opn4x e Opn4m. Ensaios de viabilidade celular e fragmentação de DNA por citometria de fluxo demonstraram que essa inibição não foi resultante de ação tóxica ou apoptótica do glutamato. O neurotransmissor não teve qualquer efeito sobre a transcrição de Per2 e de N-Acetiltransferase. A quantificação protéica não indicou a presença de ritmo para CLOCK, OPN4x ou TIROSINA HIDROXILASE. A grande variabilidade inter-ensaios nos resultados de quantificação protéica sugere uma menor sensibilidade e precisão para esse método, quando comparado a PCR quantitativo. Nossos resultados indicam que as células de retina de embrião de 8 dias de galinha em cultura já contêm um relógio funcional, porém, este necessita do ciclo claro-escuro ou glutamato para sua sincronização
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 13.10.2009
  • Acesso online ao documento

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    MZ12400015452T 57.034 L732r
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    • ABNT

      LIMA, Leonardo Henrique Ribeiro Graciani de; CASTRUCCI, Ana Maria de Lauro. Retina de aves como sistema circadiano e sua modulação por luz e glutamato. 2009.Universidade de São Paulo, São Paulo, 2009. Disponível em: < http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/41/41135/tde-26112009-141152/ >.
    • APA

      Lima, L. H. R. G. de, & Castrucci, A. M. de L. (2009). Retina de aves como sistema circadiano e sua modulação por luz e glutamato. Universidade de São Paulo, São Paulo. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/41/41135/tde-26112009-141152/
    • NLM

      Lima LHRG de, Castrucci AM de L. Retina de aves como sistema circadiano e sua modulação por luz e glutamato [Internet]. 2009 ;Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/41/41135/tde-26112009-141152/
    • Vancouver

      Lima LHRG de, Castrucci AM de L. Retina de aves como sistema circadiano e sua modulação por luz e glutamato [Internet]. 2009 ;Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/41/41135/tde-26112009-141152/

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