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Isolamento, caracterização, clonagem e expressão de genes de fatores de crescimento celular a partir de um banco de cDNA de fígado fetal humano (2009)

  • Authors:
  • USP affiliated authors: AMARANTE, MARIA FERNANDA DE CASTRO - FMRP
  • USP Schools: FMRP
  • Sigla do Departamento: RCM
  • Subjects: EXPRESSÃO GÊNICA; FÍGADO; FATORES DE CRESCIMENTO; CÉLULAS-TRONCO
  • Language: Português
  • Abstract: As células-tronco hematopoéticas (CTHs) habitam diferentes nichos durante o desenvolvimento do organismo. O fígado fetal é considerado o principal sítio da hematopoese entre a sexta e a 24ª semana de gestação, período caracterizado pela alta expansão das CTHs (Yu et aI, 2009). A possibilidade de expandir as CTHs na presença de citocinas recombinantes surgiu com a necessidade de acelerar a enxertia pós-transplante em pacientes com câncer. Sabe-se que in vivo as CTHs podem se dividir sem perder as capacidades de renovação e diferenciação, mantendo seu potencial por toda a vida do indivíduo (Till et aI, 1964). No entanto, ainda não se conhece todos os fatores necessários para que isso ocorra, nem se seria possível reproduzir os estímulos do microambiente do nicho in vitro. Este trabalho tem como objetivo identificar, clonar e expressar proteínas do fígado fetal importantes para o desenvolvimento das CTHs in vitro. O RNA mensageiro foi extraído de fígado fetal de 24 semanas de gestação. A partir deste material, foi construído um banco de cDNA e os genes foram avaliados com o auxílio da ferramenta Generic Est Annotation Pipeline (GEAP). A ontologia dos genes foi analisada utilizando as ferramentas disponíveis no site (http://babelomics.bioinfo.cipf.es/). Os genes da hemangiopoetina (HAPO) e da vitronectina (VN) foram amplificados a partir do RNA do fígado fetal e clonados no sistema ‘TOPO POT. ®’. Em seguida, foram ligados ao vetor de expressão pEGFP-N1 eexpressos em sistema eucarioto (SK-HEP-1) utilizando a técnica de transfecção por lipofectamina. As análises para a detecção dos transcritos e da proteína recombinante foram realizadas por meio das técnicas de PCR convencional (primers específicos para os genes da VN e da HAPO), PCR quantitativo (qPCR) utilizando o reagente Power SYBR PCR Master Mix, espectrometria de massa (MALDI TOF/TOF) e microscopia confocal (anticorpos secundários marcados com Alexa-‘fluor POT. ®’ 488 para detecção da VN e com isotiocianato de fluoresceína-FITC para detecção da HAPO), 48 h após a transfecção e por citometria de fluxo após a seleção com geneticina (G418). Alguns genes isolados deste banco estão relacionados a processos importantes para a manutenção das CTHs in vitro, tais como proliferação, resposta a estímulos externos e endógenos, adesão e comunicação celular. Estes genes são componetes da matriz extracelular (MEC), como por exemplo, a vitronectina (VN), o nidogeno 1 (NID1) e a fibronectina 1 (FN1), componentes intracelulares como a fosfatase de especificidade dupla (DUSP6), a macroglobulina ‘alfa’-2 (A2M) e o hemogeno (EDAG) ou componentes da membrana celular como a estomatina (STOM) e o receptor de adiponectina 1 (ADIPOR 1). Além disso, os transcritos descritos acima estão relacionados com a atividade dos fatores de transcrição NF-?B, Myc e Smad-3, os quais têm participação no desenvolvimento das CTHs. A análise das seqüências dos genesisolados neste estudo comprovou que o gene da VN (267 pb) tem 99% de identidade com o gene da vitronectina humana (NM_000638). A análise demonstrou também a presença da sequência referente ao peptídeo sinal e que o provável peso molecular da VN recombinante (‘VN IND. rp’) é de 10,5 KDa. O outro gene isolado (HAPO) possui os exons 1,2 e parte do exon 3 da variante C do gene da proteoglicana 4 (PRG4) (NM_001127710). O gene da HAPO recombinante (‘HAPO IND. rp’) não apresenta o peptídeo sinal e tem um peso molecular de 35 KDa. Ambos os genes possuem as seqüências que codificam os domínios somatomedina B e hemopexina. A presença dos transcritos da VN e da HAPO foi diretamente detectada por PCR e por qPCR, que detectou uma alta concentração dos transcritos em fusão com o gene da GFP proveniente do vetor plasmidial. A presença das proteínas ‘VN IND. rp' e ‘HAPO IND. rp’ foi indiretamente confirmada pela técnica em citometria de fluxo. A GFP foi detectada em 42,76% e 21,09% das células SK-HEP-1 transfectadas com as construções [pEGFP-N1 + VN] e [pEGFP-N1 + HAPO], respectivamente. Além disso, a análise da banda de 35 KDa recortada do gel SDS-PAGE em espectrômetro de massa demonstrou a presença do íon equivalente a GFP a partir do sobrenadante do cultivo das células SK-HEP-1 transfectadas com a construção [pEGFP-N1 + VN]. As análises em microscópio confocal demonstraram a presença de fluorescência emitida pelas células transfectadas com asconstruções [pEGFP-N1 + VN] e [pEGFP-Nl + HAPO]. Entretanto, a fluorescência observada nas células marcadas com os anticorpos primário e secundário não confirma a presença das proteínas ‘VN IND. rp’ e ‘HAPO IND. rp’, uma vez que a fluorescência emitida pela GFP e pelos fluoróforos Alexa-‘fluor POT. ®’ 488 e FITC estavam sobrepostas. Este estudo demonstrou que o fígado fetal humano é um ambiente rico em genes que atuam direta ou indiretamente no comportamento de células hematopoéticas maduras e primitivas. Este trabalho mostrou também que as células SK-HEP-1 produzem eficientemente o RNA mensageiro dos genes alvo em fusão com o gene da GFP e sugere, pela identificação da GFP, que as proteínas ‘VN IND. rp’ e ‘HAPO IND. rp’ foram expressas pelas células SK-HEP-1 transfectadas com as construções [pEGFP-N1 + VN] e [pEGFP-N1 + HAPO] por Lipossomos
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 08.10.2009

  • Exemplares físicos disponíveis nas Bibliotecas da USP
    BibliotecaCód. de barrasNúm. de chamada
    FMRP11200038122Amarante, Maria Fernanda de C.
    How to cite
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    • ABNT

      AMARANTE, Maria Fernanda de Castro; COVAS, Dimas Tadeu. Isolamento, caracterização, clonagem e expressão de genes de fatores de crescimento celular a partir de um banco de cDNA de fígado fetal humano. 2009.Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2009.
    • APA

      Amarante, M. F. de C., & Covas, D. T. (2009). Isolamento, caracterização, clonagem e expressão de genes de fatores de crescimento celular a partir de um banco de cDNA de fígado fetal humano. Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto.
    • NLM

      Amarante MF de C, Covas DT. Isolamento, caracterização, clonagem e expressão de genes de fatores de crescimento celular a partir de um banco de cDNA de fígado fetal humano. 2009 ;
    • Vancouver

      Amarante MF de C, Covas DT. Isolamento, caracterização, clonagem e expressão de genes de fatores de crescimento celular a partir de um banco de cDNA de fígado fetal humano. 2009 ;