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Caracterização bioquímica da atividade lipásica de Scytalidium thermophilum RP-250: uma linhagem hipersecretora de lipases (2010)

  • Authors:
  • USP affiliated authors: GENTIL, SANDRA LAZARI - FFCLRP
  • USP Schools: FFCLRP
  • Sigla do Departamento: 593
  • Subjects: LIPASE (ATIVIDADE); AZEITE; BIOQUÍMICA; MICROBIOLOGIA
  • Language: Português
  • Abstract: As lipases destacam-se entre as hidrolases aplicadas industrialmente, sendo adicionadas a sabões e empregadas na indústria óleoquímica, produção de implementos agrícolas, fármacos quirais, cosméticos e biodiesel, além do tratamento de efluentes gordurosos. Hidrolisam ligações éster de triacilgliceróis, liberando ácidos graxos e glicerol, além de ésteres sintéticos, como o p-nitrofenilpalmitato (pNPP). Além disso, catalisam reações de síntese em meios aquo-restritos. Em meio líquido, 98% da atividade lipásica total produzida por S. thermophilum foi detectada no meio extracelular. Níveis máximos de atividade total foram obtidos em meio suplementado com óleo de oliva (59,1 ± 4,7 U) ou farelo de soja com óleo de oliva (57,5 ± 4,2 U), mas a atividade específica obtida apenas com óleo de oliva (18,4 ± 1,6 U/mg) foi 2 vezes maior. Entre os óleos vegetais, o melhor indutor foi óleo de oliva (72,8 ± 5,8 U), seguido pelo de canela (47,5 ± 3,8 U); atividades específicas próxima (≈24 U/mg) foram estimadas para ambos os óleos. Atividade total de 4% do controle (óleo de oliva 1%) foi produzida em glicose 1% e a adição de glicose 1% ao óleo de oliva 1% inibiu 70% da produção enzimática, sugerindo repressão catabólica. Um aumento acentuado da atividade total e específica ocorreu com a re-incubação do micélio pré-crescido em glicose em meio contendo óleo de oliva, comparado ao micélio re-incubado em glicose, mas a pré-incubação não levou a maior produção. Os ácidos oléico e esteárico, mas não glicerol, foram boas fontes de carbono. Apenas o ácido oléico induziu a produção de lipase, com atividade total e específica 6 e 4 vezes menores que o óleo de oliva. Em presença de óleo de oliva, o ácido oléico não afetou a produção de lipase, mas o ácido esteárico foi um forte repressor. A melhor fonte de nitrogênio para a produção de lipase foi farinhae soja (atividade total 617,2 ± 37,0 U; atividade específica 47,8 ± 3,3 U/mg), seguida por farelo de trigo (116,5 ± 9,3 U e 39,1 U/mg). O pH inicial do meio de cultivo para máxima produção foi 6,0-7,0 e o aumento da atividade ao longo do cultivo foi acompanhado por elevação do pH para 8,5. As melhores condições de cultivo para produção de lipase foram 40’graus’C, 140 rpm e 120 h, em meio contendo ‘K IND.2’HP’O IND.4’ 0,1%, MgS’O IND.4’.7’H IND.2’O 0,05%, farinha de soja 1%, óleo de oliva 1% e pH inicial 7,0. Nessas condições, a produção atingiu 12,4 U/mL de meio de cultivo, caracterizando S. thermophilum como um bom produtor de lipases. Uma lipase extracelular foi imobilizada em DEAE-celulose e após a imobilização, a atividade lipásica foi de 15,9 U/g de resina, com 145% de rendimento, indicando que ocorreu estimulação da enzima. A atividade específica da enzima imobilizada foi 138,5 U/mg de proteína, 3 vezes maior que a do extrato bruto. SDS-PAGE do extrato bruto, sobrenadantes das lavagens e proteínas imobilizadas (removidas da resina por fervura com SDS 1% por 15 min e tratamento com uréia 8M por 48h a temperatura ambiente), mostrou imobilização seletiva da lípase. Apenas duas bandas protéicas foram reveladas na amostra removida da resina, uma majoritária (61 kDa) e uma contaminaste (49 kDa), em contraste com as múltiplas bandas protéicas no extrato bruto e sobrenadantes. A amostra imobilizada foi mais estável à estocagem, sendo ativada 1,7 vezes após 7 dias a 4’graus’C e mantendo atividade constante por 60 dias. A forma livre perdeu rapidamente a atividade a -20 e 4’graus’C, sendo estável somente em banho de gelo na geladeira, com perda de 25% da atividade após 6 meses. O pH ótimo para a enzima livre foi 6,0 e a atividade decaiu abruptamente abaixo e acima deste valor. A enzima imobilizada apresentou atividade constante de pH 5,5 a 8,0,mantendo 70% do valor máximo até pH 9,0. A enzima livre apresentou atividade ótima a 50°C, decaindo acentuadamente acima e abaixo deste valor, enquanto a enzima imobilizada manteve atividade constante entre 40 e 55’graus’C, e 80% do valor máximo a 35’graus’C. A enzima livre foi estável por 6h a 50’graus’C, com tempo de meia vida de 3h e 24 min a 60’graus’C. Já a atividade da enzima imobilizada foi estimulada 2,8 vezes após 2h a 50’graus’C, mantendo-se acima do controle até 6h. A 60’graus’C, a atividade enzimática foi estimulada 4 vezes após 2h, mantendo-se 2,4 vezes maior que o controle após 4h. As duas formas da enzima foram completamente inativadas após 24h em ambas as temperaturas, mas a enzima imobilizada recuperou 100% da atividade inicial após incubação por lh em banho de gelo, enquanto a enzima livre permaneceu inativa. O estudo da especificidade de substrato revelou que tanto a enzima livre quanto imobilizada hidrolisa preferencialmente ésteres de cadeia longa (10-16 carbonos) e hidrolisam mal pNP-acetato e pNP-butirato, além de pNP-estearato. A atividade da enzima livre foi fortemente inibida por ‘Cu POT.2+’, ‘Hg POT.2+’ e ‘Fe POT.3+’ (1 mM). Na mesma concentração, ‘Zn POT.2+’ inibiu parcialmente (36%), enquanto ‘Co POT.2+’, ‘Mg POT.2+’, ‘Mn POT.2+’, ‘Pb POT.2+’ e Ca POT.2+’ estimularam a atividade 1,4, 1,5, 1,9, 2,0 e 2,3 vezes, respectivamente. Íons ‘Ca POT.2’+ estimularam a atividade da enzima livre até um máximo de 3,5 vezes, em concentração 8 mM, enquanto a enzima imobilizada foi estimulada 4,8 vezes, em concentração 11 mM. Íons Pb2+ estimularam a atividade da enzima livre e imobilizada até um máximo de 4 vezes, em concentração 1 mM. Acima das concentrações ótimas, os tons provocaram inibição da enzima, nas duas formas. Os tons ‘Ca POT.2+’ e ‘Pb POT.2+’ nãoestimularam sinergicamente a atividade da enzima livre, mas tiveram efeito protetor sobre a inibição por ‘ Hg POT.2+1. Íons ‘Ca POT.2+’, mas não Pb2+, protegeram parcialmente a enzima da inibição por ‘Cu POT.2+’. O EDTA inibiu parcialmente a atividade, confirmando a importância de tons bivalentes para a atividade catalítica da lipase em estudo. A enzima livre foi completamente inibida por etanol e acetonitrila (10% v/v) após 30 min a temperatura ambiente, mas releve 81, 74, 70 e 44% da atividade controle após 60 min em presença de isopropanol, DMSO, metanol e éter, respectivamente. Imediatamente após a mistura solvente-enzima, a atividade residual foi nula para n-hexano, mas após 90 min atingiu um valor 2 vezes maior que o controle. A atividade residual também foi nula imediatamente após a mistura com acetona ou tolueno 10% (v/v), atingindo 30% e 73% do controle, respectivamente, após lh. A enzima imobilizada foi mais resistente ao etanol, mantendo 50% da atividade controle após lh. Além disso, sua atividade se manteve constante no momento da mistura com n-hexano e foi estimulada 1,3 vezes após 60 min. A atividade da enzima livre após incubação por lh com concentrações crescentes de nhexano atingiu um valor 40% maior que o controle para uma concentração de 40% (v/v) do solvente, caindo a zero em concentrações maiores. A atividade da enzima imobilizada chegou a um valor 3 vezes maior que o controle em concentração de 80% (v/v) do solvente, caindo a zero em concentrações maiores. A atividade sobre o óleo de oliva foi muito menor que sobre PNPP, tanto para a enzima livre quanto imobilizada. Íons ‘Ca POT.2+’ não estimularam esta atividade e íons ‘Pb POT.2+’ provocaram inibição de 50%. Algumas lipases microbianas hidrolisam triacilgliceróis com velocidades maiores que pNPP, mas o comportamento inverso também foi observado. Dadas ascaracterísticas de estabilidade em solventes, é possível que a enzima em estudo apresente boa atividade em reações de síntese, ainda não investigadas. As atividades da enzima livre e imobilizada sobre óleo de oliva foram comparadas empregando no meio reacional o mesmo número total de unidades de atividade enzimática sobre pNPP. Em pH 6,5, a atividade da enzima imobilizada foi 6,6 e 3,4 vezes maior, em concentrações de óleo de 4 e 15%, respectivamente. Em pH 8,0, a atividade da enzima imobilizada foi 14 e 5 vezes maior, nas mesmas concentrações de substrato. Assim, a enzima imobilizada apresenta maior atividade sobre o óleo de oliva que a enzima livre, como observado para o pNPP. Concluindo, a imobilização da lipase extracelular de S. thermophilum em DEAE-celulose resultou numa enzima com características muito mais interessantes que as da enzima livre, para uma possível aplicação biotecnológica, tais como: boa estabilidade a estocagem em geladeira por até 60 dias, com estimulação de cerca de 1,7 vezes após 7 dias; maior atividade hidrolítica frente ao pNPP e ao óleo de oliva; imobilização seletiva, levando à eliminação de vários contaminantes que poderiam interferir num processo de interesse; atividade alta numa faixa ampla de pH (4,5 - 9,0), melhorando a aplicabilidade em diferentes processos; baixa sensibilidade à temperatura de reação entre 35 e 50’graus’C, podendo diminuir custos com energia; estimulação de cerca de 2,6 e 4 vezes por incubação a 50 e 60’graus’C, respectivamente, mantendo atividade superior ao controle por 6h a 60’graus’C; recuperação da atividade por incubação em banho de gelo após inativação térmica completa; estimulação de cerca de 3 vezes em presença de n-hexano em concentração de 80% (v/v), sugerindo possíveis aplicações em reações de síntese
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 24.08.2010

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    FCLRP20800041109Lazari, Sandra Abrão
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    • ABNT

      LAZARI, Sandra Abrão; FURRIEL, Rosa dos Prazeres Melo. Caracterização bioquímica da atividade lipásica de Scytalidium thermophilum RP-250: uma linhagem hipersecretora de lipases. 2010.Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2010.
    • APA

      Lazari, S. A., & Furriel, R. dos P. M. (2010). Caracterização bioquímica da atividade lipásica de Scytalidium thermophilum RP-250: uma linhagem hipersecretora de lipases. Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto.
    • NLM

      Lazari SA, Furriel R dos PM. Caracterização bioquímica da atividade lipásica de Scytalidium thermophilum RP-250: uma linhagem hipersecretora de lipases. 2010 ;
    • Vancouver

      Lazari SA, Furriel R dos PM. Caracterização bioquímica da atividade lipásica de Scytalidium thermophilum RP-250: uma linhagem hipersecretora de lipases. 2010 ;