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Tese

Proteínas de micronema de Toxoplasma gondii: avaliação estrutural e das atividades biológica e vacinal (2010)

  • Authors:
  • Autor USP: PINZAN, CAMILA FIGUEIREDO - FMRP
  • Unidade: FMRP
  • Sigla do Departamento: RBI
  • Subjects: TOXOPLASMA GONDII; VACINAÇÃO; IMUNOLOGIA
  • Language: Português
  • Abstract: As proteínas de micromema TgMICl, TgMIC4 e TgMIC6 (MICs) de Toxoplasmn gondii formam um complexo na superfície do parasita responsável pela adesão e invasão a muitos tipos celulares. Sabe-se que a liberação desse complexo é pré-requisito para o estabelecimento e manutenção da infecção. Este estudo teve como objetivo (1) produzir as proteínas recombinantes TgMIC1 e TgMIC4 de T. gondii; (2) estudar essas proteínas recombinantes, bem como proteínas ligantes de lactose (complexo Lac+) isoladas do parasita, quanto a aspectos estruturais e de especificidade de ligação a glicanas; (3) avaliar atividades biológicas desempenhadas pelas proteínas recombinantes e pela fração Lac+ de T. gondii; (4) investigar a propriedade vacinal das proteínas recombinantes e da fração Lac+ de T. gondii. O insucesso das abordagens para produzir as proteínas recombinantes na forma solúvel motivou a sua purificação a partir de corpos de inclusão. Após a realização de procedimentos de refolding, as preparações obtidas mostraram-se solúveis, homogêneas e contendo as proteínas corretamente dobradas. A estrutura do complexo Lac+, constituído pelas proteínas TgMICl/4 nativas, foi avaliada por microscopia eletrônica, que revelou ser o complexo correspondente a partículas circulares de excelente simetria, adequadas para estudos futuros de reconstituição em três dimensões do complexo TgMICl/4. A eletroforese em condições não desnaturantes mostrou que o complexo Lac+ tem massa molecular aparente de 669kDa que, em condições desnaturantes (mas não redutoras) origina componentes protéicos de 420 e 240kDa. Postulamos que o componente de 420kDa corresponda a hexâmeros de TgMIC4, enquanto o de 240kDa corresponda a tetrâmeros de TgMIC1. A associação entre esses dois tipos de oligômeros seria estabelecida por ligações não covalentes. Já a oligomerização de moléculas de TgMIC4 (70kDa) e de TgMIC1(60kDa), respectivamente, ocorreria por interações covalentes. A existência na fração Lac+ de TgMIC6 foi investigada, uma vez que há relatos de que essa proteína seja responsável pelo ancoramento de TgMIC1/4 na membrana do parasita. Através de imunoblot descartou-se a inclusão de TgMIC6 nos complexos Lac+, purificado do parasita. A análise por glycoarray, mostrou que rTgMIC1 liga-se a glicanas terminadas em sialil-lactosamina e rTgMIC4 liga-se a glicanas terminadas em lactosamina. A análise das proteínas nativas, contidas na fração Lac+, mostrou ligação a ambos os tipos de glicanas, como esperado. Ensaios de atividade biológica demonstraram que os três principais tipos de células fagocíticas (neutrófilos, macrófagos e células dendriticas) produzem IL-12 em resposta ao estímulo com as preparações de MICs. Além disso, células dendríticas pulsadas com essas preparações induziram a produção de IFN-'úpsilon' por células T CD4. Células HEK 293 tranfectadas com plasmídeo de TLR2 em associação com plasmídeo contendo NF’capa’B combinado com gene repórter de luciferase frente ao estímulo com rTgMIC1, rTgMIC4 ou Lac+ tiveram NF’capa’B translocado, sugerindo que essas lectinas interajam com glicanas associadas ao ectodomínio de TRL2. Realizamos experimentas com o intuito de averiguar se o processo de imunização com as diferentes proteínas de micronemas ou combinações das mesmas, geraria proteção de camundongos contra a toxoplasmose. A imunização induziu um padrão de resposta humoral misto, verificado pelos níveis séricos similares de IgG1 e IgG2b reativos com antígeno solúvel de T. gondii. Induziu ainda além disso, resposta celular de padrão Thl (protetor na toxoplasmose), manifesto pela detecção das citocinas IFN-'úpsilon' e IL-12, mas não de IL-4, nos sobrenadantes de cultura das células esplênicas dos animais imunizados. Animais imunizados e desafiadosoralmente com cistos da cepa ME49 de T. gondii apresentaram uma redução significativa na mortalidade e no número de cistos cerebrais, em comparação aos animais controles. A ocorrência de redução de 68% na detecção de cistos cerebrais e o aumento de 80 % da sobrevida dos camundongos imunizados com a preparação constituída de rTgMIC1-4-6, mostra que essa preparação vacinal foi a melhor indutora de proteção, podendo corresponder a uma forte candidata a constituir preparação vacinal que evite ou amenize os efeitos deletérios da infecção por T. gondii
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 18.10.2010
    • How to cite
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    • ABNT

      PINZAN, Camila Figueiredo. Proteínas de micronema de Toxoplasma gondii: avaliação estrutural e das atividades biológica e vacinal. 2010. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2010. . Acesso em: 19 abr. 2024.

    • APA

      Pinzan, C. F. (2010). Proteínas de micronema de Toxoplasma gondii: avaliação estrutural e das atividades biológica e vacinal (Tese (Doutorado). Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto.

    • NLM

      Pinzan CF. Proteínas de micronema de Toxoplasma gondii: avaliação estrutural e das atividades biológica e vacinal. 2010 ;[citado 2024 abr. 19 ]

    • Vancouver

      Pinzan CF. Proteínas de micronema de Toxoplasma gondii: avaliação estrutural e das atividades biológica e vacinal. 2010 ;[citado 2024 abr. 19 ]

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