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Estrutura e função das cisteína proteinases intestinais do besouro Tenebrio molitor (2009)

  • Authors:
  • USP affiliated authors: BETON, DANIELA - IQ
  • USP Schools: IQ
  • Sigla do Departamento: QBQ
  • Subjects: BIOQUÍMICA ANIMAL; PROTEINASES (ESTRUTURA); INTESTINO DE ANIMAL (ENZIMOLOGIA;ESTUDO)
  • Language: Português
  • Abstract: A catepsina L é uma cisteína proteinase da família da papaína (clã CA, família C1), sendo esta família a mais conhecida entre as cisteína proteinase. A catepsina L, como outras proteinases da família C1, é sintetizada como uma pró-enzima inativa que é ativada através da remoção do pró-peptídeo. Os pró-peptídeos das catepsinas da subfamília catepsina L apresentam um motivo consenso, denominado motivo ERFNIN. A catepsina L corresponde a principal proteinase digestiva em Tenebrio molitor. No nosso laboratório 3 pró-catepsinas L (pCALs) foram clonadas e seqüenciadas a partir de uma biblioteca de cDNA de intestino médio de larvas de T. molitor: pCAL1 (CAL lisossomal), pCAL2 e pCAL3 (enzimas digestivas). Estas proteinases apresentam o motivo ERFNIN e os resíduos envolvidos na catálise: Cys25, His169, e Asn175 com Gln19 (numeração da papaína). Neste trabalho descrevemos a clonagem em vetores de expressão e a expressão em bactérias das sequências codificadoras de pCAL1, pCAL2 e pCAL3. As pró-catepsinas L recombinantes foram purificadas por cromatografia de afinidade e a incubação em pH ácido resultou na formação das enzimas maduras CAL1, CAL2 e CAL3 com atividade sobre o substrato Z-FR-MCA. O anticorpo policlonal anti-pCAL2 foi produzido em coelho e reconheceu pCAL2 e CAL2 em immunoblots. Experimentos de immunoblots com diferentes tecidos de T. molitor mostraram que o anticorpo policlonal anti-pCAL3 reconheceu pCAL3 e CAL3 nos dois terços anteriores do intestino médio de larvas deT. molitor. Estudos de imunocitolocalização indicam que a catepsina L 3 ocorre em vesículas no intestino médio anterior e em microvilosidades no intestino médio posterior. Para os experimentos de cristalização, nós expressamos pCAL1, pCAL2 e pCAL3 como mutantes Cys25→Ser inativos. pCAL3Cys26Ser foi cristalizada por difusão de vapor (gota sentada) contra 0,1-1,6M de dihidrogênio fosfato de amônio. Os cristais são monoclínicos com grupo espacial C2 e parâmetros de célula: a=57,634 Å, b=89,322 Å, c=70,076 Å, α=γ=90=90°, β=92,502° e uma molécula na unidade assimétrica. A e strutura foi determinada por substituição molecular usando a estrutura de Fasciola hepatica (42% de identidade) como modelo. O modelo foi refinado a 2,1 Å com fator R final de 16,19% (´RIND.free´=20,5%). pCAL2Cys25Ser foi cristalizada por difusão de vapor (gota sentada) contra acetato de sódio 0,2M, cacodilato de sódio 0,1M pH6,6-6,7 e 20% de PEG 8000. Os cristais são triclínicos com grupo espacial P1 e parâmetros de célula: a=51,669 Å, b=52,37 Å, c=59,716 Å, α= 91,278°, y=109,586°, β=91,547° e duas moléculas na unidade assimétrica. A estrutura foi determinada por substituição molecular usando a estrutura da pCAL3 (44% de identidade) como modelo. O modelo foi refinado a 2,0 Å com fator R final de 17,61% (´RIND.free´=22,48%). A estrutura terciária da pró-catepsinas L digestivas é muito similar as estruturas de cisteína proteinases da família da papaína
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 17.12.2009
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    • ABNT

      BETON, Daniela; TERRA, Walter Ribeiro. Estrutura e função das cisteína proteinases intestinais do besouro Tenebrio molitor. 2009.Universidade de São Paulo, São Paulo, 2009. Disponível em: < http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-28042010-141010/ >.
    • APA

      Beton, D., & Terra, W. R. (2009). Estrutura e função das cisteína proteinases intestinais do besouro Tenebrio molitor. Universidade de São Paulo, São Paulo. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-28042010-141010/
    • NLM

      Beton D, Terra WR. Estrutura e função das cisteína proteinases intestinais do besouro Tenebrio molitor [Internet]. 2009 ;Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-28042010-141010/
    • Vancouver

      Beton D, Terra WR. Estrutura e função das cisteína proteinases intestinais do besouro Tenebrio molitor [Internet]. 2009 ;Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-28042010-141010/

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