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Caracterização do padrão de integração do retrovírus pMFG-FVIII-P140K em linhagens celulares humanas produtoras de fator VIII recombinante (2011)

  • Authors:
  • USP affiliated authors: FREITAS, MARCELA CRISTINA CORRÊA DE - FMRP
  • USP Schools: FMRP
  • Sigla do Departamento: RCM
  • Subjects: HEMOFILIA; FATOR VIII; ANTICORPOS
  • Keywords: FVIII recombinante; LM-PCR; Vetor viral; Recombinant FVIII; Retroviral vector
  • Language: Português
  • Abstract: A hemofilia A é uma doença caracterizada pela deficiência do fator VIII (FVIII) de coagulação sanguínea e atinge 1 em 5000 homens. Paises desenvolvidos, utilizam como terapia o FVIII recombinante (rFVIII), por apresentar maior segurança e consistir uma fonte ilimitada. Estudos realizados em nosso laboratório, utilizando o vetor retroviral pMFG-FVIII-P140K, originaram as linhagens celulares humanas, HepG2FVIIIdB/P140K (hepática) e Hek293FVIIIdB/P140K (renal), que foram selecionadas pelo mesmo sistema de seleção, o tratamento in vitro com as drogas Benzilguanina e Temozolomide. O presente trabalho teve por objetivo caracterizar e detalhar o padrão de integração do vetor retroviral pMFG-FVIII-P140K nas duas linhagens celulares humanas, e verificar se o perfil de integração está relacionado ao tipo celular especifico ou se este sofre influência da estratégia de seleção a qual as células foram submetidas anteriormente. Foi utilizada a técnica de LM-PCR (ligação-mediada por PCR) que permite localizar o sitio de integração do vetor viral, por meio do seqüenciamento do produto de PCR obtido após a digestão com enzimas de restrição e ligação de uma seqüência adaptadora (LINKER) ao DNA genômico. Após o seqüenciamento as sequências foram submetidas a análises em bancos de dados de genomas (Human BLAT, QuickMap e DAVID/EASE) para caracterização dos respectivos clones. Também foi realizada uma análise da expressão relativa do mRNA relativo ao rFVIII por RT-PCR e da atividade biológica pelo teste de TTPA. Dessa forma foi possível observar que ambas as linhagens modificadas expressam o mRNA relativo ao rFVIII e que as células HepG2 e Hek293 apresentam níveis de secreção da proteína recombinante biologicamente ativa da ordem de 7,9 Ul/mL e 2,1 Ul/mL, respectivamente. Foram seqüenciados um total de 201 clones da HepG2, sendo 123 similares ao genoma humano e dentre estes 73 considerados verdadeirose 50 ambíguos. Da Hek293 foram seqüenciados 221 clones, sendo 179 similares ao genoma humano e dentre estes 64 verdadeiros e 1 15 ambíguos. Observamos que o vetor retroviral pMFG-FVIII-P140K apresenta um perfil de integração não randômico e diferente entre as células estudadas, uma vez que na linhagem HepG2 houve uma preferência pelos cromossomos 19, 17 e 11, e na Hek293 pelo cromossomo 9. Em relação a regiões genômicas tais como distancia de ilhas CpGs e de sítios de ligação de fatores de transcrição não houve diferença no perfil de integração em ambas as linhagens celulares, visto que nas duas células o vetor se inseriu preferencialmente a uma distancia de i 3060Kb dessas regiões. Observamos também que houve uma integração dentro de genes codificadores de proteínas da ordem de 52% e 44% nas células HepG2 e Hek293, respectivamente, contudo em ambos os casos mais de 90% dessas inserções ocorreram em regiões intrônicas. Houve 20% de integrações em sítios frágeis do genoma na linhagem HepG2 e 17% na Hek293. Em suma este trabalho mostrou a integração do vetor retroviral pMFG-FVIII-P140K especifica para as duas linhagens em estudo. Além disso, pudemos observar que em ambas as linhagens celulares, HepG2FVIIIdB/P140K e Hek293FVIIIdB/P140K, existem regiões gênicas dentro dos cromossomos na qual o vetor exibe uma preferência. O perfil de integração caracterizado aqui difere de outros trabalhos da literatura que utilizaram retrovírus derivados de MLV. Isso nos leva a crer que o padrão de inserção descrito pode estar relacionado ao fato de que essas células foram tratadas anteriormente com drogas quimioterapêuticas para seleção de um clone celular com maior nível de produção de rFVIII, levando conseqüentemente a seleção de um perfil de integração semelhante entre as linhagens celulares, mesmo estas tendo origens teciduais diferentes
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 14.03.2011
  • Acesso online ao documento

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    FMRP11200057007Freitas, Marcela Cristina Corrêa de
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    • ABNT

      FREITAS, Marcela Cristina Corrêa de; FONTES, Aparecida Maria. Caracterização do padrão de integração do retrovírus pMFG-FVIII-P140K em linhagens celulares humanas produtoras de fator VIII recombinante. 2011.Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2011. Disponível em: < http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17138/tde-06072015-155930/ >.
    • APA

      Freitas, M. C. C. de, & Fontes, A. M. (2011). Caracterização do padrão de integração do retrovírus pMFG-FVIII-P140K em linhagens celulares humanas produtoras de fator VIII recombinante. Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17138/tde-06072015-155930/
    • NLM

      Freitas MCC de, Fontes AM. Caracterização do padrão de integração do retrovírus pMFG-FVIII-P140K em linhagens celulares humanas produtoras de fator VIII recombinante [Internet]. 2011 ;Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17138/tde-06072015-155930/
    • Vancouver

      Freitas MCC de, Fontes AM. Caracterização do padrão de integração do retrovírus pMFG-FVIII-P140K em linhagens celulares humanas produtoras de fator VIII recombinante [Internet]. 2011 ;Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17138/tde-06072015-155930/

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