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Produção, purificação e caracterização bioquímica das lipases produzidas pelos fungos termófilos Malbranchea pulchella var. suffurea e Humicola sp. (2012)

  • Authors:
  • USP affiliated authors: PEREIRA, MARITA GIMENEZ - FFCLRP
  • USP Schools: FFCLRP
  • Sigla do Departamento: 592
  • Subjects: FUNGOS TERMÓFILOS; LIPASE; BIOQUÍMICA; ENZIMAS (ISOLAMENTO E PURIFICAÇÃO)
  • Language: Português
  • Abstract: As lipases (E.C. 3.1.1.3) catalisam a hidrólise de óleos em mono- e diacilgliceróis e ácidos graxas livres. Elas são amplamente produzidas por microorganismos, formando um importante grupo biotecnológico de enzimas com diversas propriedades e especificidades. As lipases têm sido empregadas na síntese de biopolimeros e biodiesel, na produção de fármacos, agroquímicos, síntese de esteres, detergentes, tratamento de efluentes, remoção de lipídios das peles de animais, na indústria farmacêutica e cosmética e na produção de alimentos. As linhagens de microorganismos taxonomicamente próximas podem produzir lipases de diferentes tipos. O ambiente contendo resíduos oleosos (esgoto, depósitos de lixo e efluentes de fábricas) promove um bom habitat para o crescimento e isolamento desses microorganismos lipolíticos. Os fungos Malbranchea pulchella e Humicola sp. são termofilicos e vivem normalmente na decompostagem. Este trabalho teve como objetivo otimizar a produção de lipases de M. pulchella e Humicola sp., purificá-las e caracterizá-las bioquimicamente e fisiologicamente, visando o melhor conhecimento das propriedades das lipases destes fungos, seu potencial para aplicação industrial e a comparação de suas propriedades. Em fermentação submersa (FSm) os dois fungos produziram mais lipases em agitação por excursão do que quando cultivados em agitação orbital. Em FSm, M. pulchella produziu mais lipase extracelular quando crescido na presença de óleo de girassol durante cultivo de 120h e lipase intracelular na presença de óleo de canela. Humicola sp. crescido em FSm por 96h, exibiu maior produção de lipase extracelular e intracelular com 96h em óleo de gergelim e polpa de macaúba, respectivamente. A adição de gelatina aos meios de cultives não afetou a produção das lipases dos dois fungos. As lipases de M. pulchella exibiram máxima atividade na temperatura de 55°C enquanto as de Humicolaexibiram máxima atividade na faixa de 35 a 50°C. Quanto ao pH as lipases extracelulares de AI pulchella exibiram atividades máximas em pH 5 e 7, enquanto que as intracelulares exibiram atividades máximas em pH 9. As lipases extracelulares e intracelulares de Humicola sp. exibiram atividades máximas em pH 5-6 e 5.5-7.0, respectivamente. As lipases extracelulares e intracelulares de M. pulchella produzidas em FSm apresentaram uma meia vida de 26 e 21 min a 65°C, respectivamente. Já a atividade lipásica do filtrado da cultura de Humicola sp. manteve cerca de 60% da atividade inicial quando incubado em meio aquoso a 65° por um período de até lh. Já a lipase micelial de Humicola mostrou uma meia vida de 50 min a 60°C, quando incubada em tampão MES (pH 6,0). As lipases extra e intracelulares de Humicola e Malbranchea crescidos em fermentação FSm ou FSS mostraram excelentes estabilidades frente a uma ampla faixa de pH. As lipases extra e intracelulares de M. pulchella crescido em FSm foram completamente estáveis em solventes organicos por até 24h. A lipase extracelular de Humicola sp. foi estável a metanol e a acetona enq ^l~nto que a enzima intracelular foi completamente estável em acetona e acetonitrila. As lipases extra e intracelular de M. pulchella foram mais estáveis em SDS do que em Triton X-100 e Tween 80. As lipases de Humicola sp. foram estáveis em SDS e Triton X-100 e foram ativadas por Tween 80. A lipase extracelular de M. pulchella foi ativada por cálcio e manganês. A lipase extracelular de Humicola sp. foi ativada por alumínio e bário, enquanto intracelular foi ativada por cobalto, ‘beta’-mercaptoetanol, cálcio e manganês. Em FSS a produção máxima em M. pulchella ocorre com farelo de trigo e fibra de trigo com 192h, sem a necessidade da adição de óleo ao meio. A produção máxima de lipase em Humicola sp. ocorre com fibra de trigo e trigo em grãos, com 168h. Gelatina praticamente nãoinfluencia a produção de lipases enquanto que D-Glucose aumenta a produção em ambos os fungos. A temperatura ótima da lipase de M. pulchella foi de 55°C e o pH de 6,0 - 8,5. A temperatura ótima aparente da lipase de Humicola sp. foi de 50°C e uma faixa de pH Étimo aparente de 5,0 a 7,5. A meia vida da lipase de M. pulchella a 65°C foi de aproximadamente 9 min enquanto que a lipase de Humicola sp. apresentou uma meia vida de 30 min nesta mesma temperatura. Ambas as enzimas foram estáveis em todos os pHs testados. A lipase de M. pulchella foi estável em todos os solventes organicos testados, por até 24h enquanto Humicola sp. manteve cerca de 40% da sua atividade após 24h de incubação em solventes orgânicos. A estabilidade em detergentes mostrou que a enzima de M. pulchella foi estável em SDS, Tween 80 e Triton X-100 enquanto a enzima de Humicola sp. perdeu cerca de 40% e 35% da sua atividade em Triton X-100 e SDS, respectivamente. Além disso, ambas as enzimas foram ativadas por Tween 80. O processo de purificação da lipase de M. pulchella produzida em FSS consistiu na precipitação com 40% de sulfato de amónio, cromatografia em DEAE-Celulose e cromatografia em coluna de Octyl-Sepharose. Após esse procedimento a amostra foi purificada cerca de 42 vezes. A análise em SDS - PAGE mostrou uma única banda com cerca de 21 kDa. A enzima extracelular produzida em FSm por M. pulchella foi purificada por um processo que envolveu três passas de purificação. O extraio bruto foi concentrado em filtro da Amicon com poros de 30 kDa, a amostra concentrada foi cromatografada em coluna Sephacryl S-200 resultando em dois picos de atividade, denominados PI e PII. O PII foi cromatografado em coluna Octyl Sepharose e a enzima foi eluída com gradiente 0 - 5% de Triton X-100. Após análise em SDS-PAGE foi observada uma única banda com cerca de 15 kDa. As enzimas extracelulares produzidas em FSm porHumicola sp. foram purificadas por dois passas cromatográficos em coluna de DEAE-Celulose, no qual dois picos de atividade lipásica foram separados (PI e PII). As fiações (PI e PII) de DEAE-Celulose foram aplicadas separadamente em uma coluna de interação hidrofóbica (Octyl - Sepharose). O Pico I de DEAE-Celulose se transforma em dois novos picos na coluna de Octyl - Sepharose e foram denominados de PI Deae - Oc 1 e PI Deae - Oc 2. O Pico II da DEAE-Celulose resultaram em dois novos picos de atividade lipásica, denominado PII Deae - Oc 1 e PII Deae - Oc 2. Os picos das colunas de Octyl - Sepharose foram analisadas em SDS-PAGE, podendo-se observar apenas uma banda protéica estimada em cerca de 24 kDa para o PI Deae - Oc 1 e 30 kDa para o PII Deae - Oc 1. As lipases purificadas produzidas em FSS e FSm por M. pulchella exibiram um pH átimo aparente de 7,0 e 7,5, respectivarnente. As enzimas purificadas de Humicola sp. exibiram pH átimo aparente entre 5,5 e 6,5. A temperatura ótima aparente das lipases purificadas de M. pulchella foram de 50-55°C e 50°C para FSS e FSm, respectivamente. A lipase de M. pulchella de FSm foi ativada por cálcio, magnésio, manganês, alumínio e bário. As lipases PI Deae - Oc 1, PII Deae - Oc 1 e PII Deae - Oc 2 produzidas em FSm por Humicola sp. apresentaram máxima atividade a 50°C e a lipase PI Deae - Oc 2 apresentou máxima atividade a 55°C. A enzima PI Deae - Oc 1 foi ativada por cloreto de bário, ‘beta’-mercaptoetanol e cálcio. Enquanto que a PI Deae - Oc 2 foi ativada por cloreto de bário, ‘beta’-mercaptoetanol e cálcio. A enzima PII Deae - Oc 1 foi ativada por cloreto de bário, ‘beta’-mercaptoetanol, cálcio, nitrato de zinco, cloreto de sódio e de ferro, mercúrio, zinco, sulfato de cobre, cloreto de cobre e EDTA. A enzima PII Deae - Oc 2 foi ativada por cloreto de bário ‘beta’-mercaptoetanol, nitrato de zinco e de prata, cálcio,sulfato de prata, brometo de sódio, cloreto de amônio e de manganês. A meia vida da lipase purificada de M. pulchella produzida em FSS incubada à 70°C foi de aproximadamente 35 min. A lipase da FSm apresentou a meia vida a 65°C de aproximadamente 8 min. As purificadas de Humicola e denominadas de PI Deae - Oc 1 e PII Deae - Oc 2 apresentaram uma meia vida de aproximadamente 10 e 12 min à 60°C, respectivamente. O valor de ‘K IND. m’ encontrado para lipase de M. pulchella produzida por FSS foi de 0,31 mM e a ‘V IND. máx’ foi de 0,64 U/mg de proteína. O valor obtido para a lipase proveniente da FSm usando pNPP foi de 0,06 mM e a Vá, foi de 5,73 U/mg de proteína, entretanto com pNPM o valor de Km encontrado foi de 0,02 mM e a ‘V IND. máx’ foi de 28 U/mg de proteína. As enzimas purificadas de M. pulchella crescido em FSS e FSm foram totalmente estáveis em todos os pHs testados. As duas lipases purificadas de Humicola sp. (PI Deae - Oc 1 e PII Deae - Oc 1) perderam cerca de 20 e 30% de suas atividades quando incubadas em diferentes pHs. Entretanto, a enzima de Humicola obtida de cultivas de FSS foi estável em praticamente todos detergentes. A enzima de FSS produzida por M. pulchella frente a solventes orgânicos manteve apenas 40% da sua atividade em acetonitrila. O conteúdo de carboidratos foi estimado em 46% para enzima extracelular de M. pulchella cultivado em FSm e 52% para a enzima proveniente da FSS. A natureza glicoprotéica das enzimas purificadas de Humicola sp. foram estimados em 62%, 13%, 55% e 70% para as lipases PI Deae - Oc 1, PI Deae - Oc 2, PII Deae - Oc 1 e PII Deae - Oc 2, respectivamente. A lipase de M. pulchella produzida em FSS hidrolisou mais cadeias curtas (C:4) e a enzima proveniente da FSm mostrou mais atividade sobre esteres de p-nitrofenóis com cadeias com 12 e 16 carbonos. As quatro lipases purificadas de Humicola sp. mostraram mais atividade sobreesteres de p-nitrofenóis com cadeias de 4 carbonos. O estudo com fiações brutas mostrou que as lipases de M. pulchella produzidas em FSm hidrolisaram mais óleo de girassol enquanto que a lipase de Humicola hidrolisou mais azeite de oliva. As lipases de AÍ pulchella formaram a partir da hidrólise de óleo de girassol mono-, diacilglicerol e ácidos graxos. As lipases de Humicola formaram somente diacilglicerol e ácidos graxas. Em reações de tempos curtos as lipases de Malbranchea hidrolisaram trioleína enquanto que as de Humicola foram incapazes. A análise global dos resultados apresentados sugere fortemente a existência de uma diversidade muito grande de lipases existentes nos dois organismos, com um potencial muito grande de exploração. Assim esses dados contribuem para um maior entendimento das propriedades bioquímicas das lipases de fungos termófilos
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 13.01.2012

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    FCLRP20800045542Pereira, Marita Gimenez
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    • ABNT

      PEREIRA, Marita Gimenez; JORGE, João Atílio. Produção, purificação e caracterização bioquímica das lipases produzidas pelos fungos termófilos Malbranchea pulchella var. suffurea e Humicola sp.. 2012.Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2012.
    • APA

      Pereira, M. G., & Jorge, J. A. (2012). Produção, purificação e caracterização bioquímica das lipases produzidas pelos fungos termófilos Malbranchea pulchella var. suffurea e Humicola sp. Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto.
    • NLM

      Pereira MG, Jorge JA. Produção, purificação e caracterização bioquímica das lipases produzidas pelos fungos termófilos Malbranchea pulchella var. suffurea e Humicola sp. 2012 ;
    • Vancouver

      Pereira MG, Jorge JA. Produção, purificação e caracterização bioquímica das lipases produzidas pelos fungos termófilos Malbranchea pulchella var. suffurea e Humicola sp. 2012 ;

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