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Tese

Detecção e contagem de Staphylococcus aureus causador da mastite bovina em amostras de leite pelo método de quantificação da reação em cadeia da polimerase em tempo real (2012)

  • Authors:
  • Autor USP: BOTARO, BRUNO GARCIA - FMVZ
  • Unidade: FMVZ
  • Sigla do Departamento: VPS
  • Subjects: AMOSTRAGEM DE ANIMAL; LEITE (PRODUÇÃO); MASTITE ANIMAL; REAÇÃO EM CADEIA POR POLIMERASE; STAPHYLOCOCCUS
  • Keywords: Amostra do quarto mamário; Composição do leite; Contagious subclinical mastitis; Mastite subclínica contagiosa; Milk composition; Milk yield; PCR quantitativo; Produção de leite; Quantitative PCR; Quarter milk sample
  • Language: Português
  • Abstract: Os objetivos do presente estudo foram os de verificar a validade do método de reação em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR) para detectar e quantificar o Staphylococcus aureus em amostras de leite conservadas com bronopol oriundas de quartos mamários bovinos subclinicamente infectados, e de avaliar os efeitos da presença e da quantidade de células da bactéria sobre a contagem de células somáticas (CCS), a composição do leite (lactose, gordura, proteína bruta, proteína verdadeira e caseína), e a produção de leite de quartos mamários bovinos subclinicamente infectados pelo patógeno. Para a quantificação do S. aureus e das células somáticas bovinas por meio do qPCR, foi utilizado leite cru bovino para o preparo dos padrões como meio de diluição da inoculação seriada de células somáticas e do S. aureus ATCC 29213, e construídas as equações log10UFC = 37,86 23,54 log10CtSAU e log10CCS = 49,3 - 34,0 log10CtBMCB, com base nos resultados obtidos pelas metodologias de referência para cada procedimento. Para testar a equivalência dessas equações aos respectivos métodos de referência, determinar a sensibilidade e especificidade analíticas e a repetibilidade do método proposto, foram coletadas amostras de leite dos quartos mamários de 60 animais de 2 rebanhos leiteiros da região de Pirassununga dos quais se determinou previamente a ocorrência de casos subclínicos de mastite por S. aureus. Dos quartos mamários também foram mensuradas as produções e coletadas amostras de leite paraanálise de composição, diagnóstico da mastite, e determinação da sensibilidade e especificidade diagnósticas do procedimento de qPCR estabelecido no estudo. Cada amostra foi submetida à análise de composição, CCS, cultura microbiológica, contagem em placas do S. aureus, processadas para a extração do DNA genômico bovino e do S. aureus, e submetida à reação de qPCR. Para análise da concordância entre os resultados obtidos pelos métodos de referência para o diagnóstico da mastite por S. aureus e o de qPCR foi utilizado o teste Kappa. Para avaliação da equivalência das contagens obtidas pelos métodos de referência do S. aureus e de células somáticas bovinas, foi utilizado o teste das diferenças de Bland-Altman. Para a identificação do efeito da infecção subclínica pelo S. aureus sobre a composição e produção de leite do quarto mamário afetado foi utilizada a análise da variância num delineamento em parcelas subdivididas em faixas. Para estimar o grau de relação entre as contagens de S. aureus, a CCS, produção e composição do leite produzido pelo quarto mamário afetado foi utilizado o coeficiente de correlação de Pearson. A correlação entre os resultados de contagem de células somáticas bovinas determinados pelos métodos de rotina e de qPCR para a quantificação de células somáticas apresentou coeficiente r = - 0,978 (P < 0,001). A correlação entre os resultados da contagem do S. aureus ATCC 29213 determinados pelos métodos de rotina e de qPCR para a quantificação do patógenoapresentou coeficiente r = - 0,989 (P < 0,001). A especificidade analítica do qPCR para a detecção do S. aureus em amostras de leite frente a Escherichia coli, Enterococcus sp., Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus uberis, os estafilococos coagulase-negativa, e as espécies coagulase-positiva Staphylococcus hyicus e Staphylococcus intermedius foi de 100%. O método de qPCR aplicado à detecção de Staphylococcus aureus ATCC 29213 em amostras de leite é replicável e apresentou sensibilidade analítica com limite de detecção para a faixa de 10 UFC/mL à 4,2 x 106 UFC/mL. Em amostras de leite conservadas com bronopol provenientes de quartos mamários subclinicamente infectados, o S. aureus pôde ser detectado, mas não pôde ser quantificado pelo método de qPCR. Nessas amostras, a CCS pôde ser determinada de forma equivalente ao método de rotina. A CCS independe da contagem de S. aureus viáveis, mas foi observada correlação linear e negativa entre o número total de células do patógeno e a CCS. A mastite subclínica pelo S. aureus aumentou a CCS nos quartos mamários, mas não alterou a composição do leite. A doença diminuiu a produção de leite e de gordura dos quartos mamários anteriores acometidos pela infeção, mas não se observou efeito da interação entre o posicionamento da glândula e a infecção sobre a produção de leite. Houve correlação entre as concentrações de lactose (r = 0,42; P = 0,0051), de gordura (r = 0,46; P =0,0016), de produção de gordura (r = 0,49; P = 0,001), e de leite com produção ajustada para o teor de 3,5% de gordura (r = 0,41; P = 0,006), e o número de S. aureus presentes na amostra de leite
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 08.02.2012
    • Acesso à fonte
    How to cite
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    • ABNT

      BOTARO, Bruno Garcia. Detecção e contagem de Staphylococcus aureus causador da mastite bovina em amostras de leite pelo método de quantificação da reação em cadeia da polimerase em tempo real. 2012. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo, São Paulo, 2012. Disponível em: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/10/10134/tde-23072012-172142/. Acesso em: 19 abr. 2024.

    • APA

      Botaro, B. G. (2012). Detecção e contagem de Staphylococcus aureus causador da mastite bovina em amostras de leite pelo método de quantificação da reação em cadeia da polimerase em tempo real (Tese (Doutorado). Universidade de São Paulo, São Paulo. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/10/10134/tde-23072012-172142/

    • NLM

      Botaro BG. Detecção e contagem de Staphylococcus aureus causador da mastite bovina em amostras de leite pelo método de quantificação da reação em cadeia da polimerase em tempo real [Internet]. 2012 ;[citado 2024 abr. 19 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/10/10134/tde-23072012-172142/

    • Vancouver

      Botaro BG. Detecção e contagem de Staphylococcus aureus causador da mastite bovina em amostras de leite pelo método de quantificação da reação em cadeia da polimerase em tempo real [Internet]. 2012 ;[citado 2024 abr. 19 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/10/10134/tde-23072012-172142/

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