Imobilização covalente e não-covalente de β-xilosidase purificada e produção de derivados ativos estabilizados (2012)
- Authors:
- Autor USP: BENASSI, VIVIAN MACHADO - FMRP
- Unidade: FMRP
- Sigla do Departamento: RBI
- Subjects: ASPERGILLUS; ENZIMAS
- Language: Português
- Abstract: A aplicação biotecnológica do sistema xilanolítico vem aumentando consideravelmente devido à utilização no clareamento da polpa de celulose - produção de papel, ração animal, etc. Dentre as enzimas xilanolíticas, podem-se citar as β-xilosidases que se caracterizam por hidrolisar xilooligossacarídios à xilose. Dessa forma, esse trabalho teve como objetivo: (a) seleção de linhagens de fungos termotolerantes com excelente potencial para produção de β-xilosidases, (b) padronização das condições de cultivo do fungo selecionado, (c) purificação da β-xilosidase, (d) imobilização enzimática utilizando-se diferentes suportes químicos e (e) caracterização bioquímica das formas: bruta, purificada e imobilizadas. Realizou-se um "screening" de doze fungos, estabelecendo para este trabalho o Aspergillus niger USP-RP67, levando em consideração a sua excelente produção de β-xilosidase e o crescimento às altas temperaturas. Várias composições de meios foram analisadas e estabeleceu-se para a produção enzimática um novo meio de cultura - Meio Benassi, onde se padronizou os cultivas em condições estáticas, 30°C, durante seis dias, utilizando-se extraio de levedura como fonte de nitrogênio. Vários resíduos agroindustriais foram testados, e verificou uma favorável produção intra e extracelular de ,β-xilosidase em sabugo de milho, serragem de eucalipto, farinha de mandioca, bagaço de cana-de-açúcar e farelo de trigo. A β-xilosidase foi purificada em DEAE-Sepharose e em filtração em gel ‘Superdex POT. TM’ 200, observando-se uma massa molar de 96 kDa. A enzima foi imobilizada reversivelmente em suportes iônicos, sendo a melhor imobilização verificada em DEAESepharose, PEI e Sepharose Q, apresentando uma média de 95% de rendimento de imobilização. Em relação à estabilidade térmica, constatou-se que a enzima imobilizada em PEI foi mais estável a 45°C, pH 4,5 e 5,0estável a 45°C, pH 4,5 e 5,0. O extrato bruto e a enzima imobilizada em PEI possuíram um pH ótimo de atividade em torno de 4,5 e a enzima purificada ao redor de 5,5. A temperatura ideal foi de 75°C-80°C para a enzima solúvel, e 65°C para a imobilizada em PEI. A enzima solúvel ou imobilizada manteve 90% de sua atividade original entre pH 5 e 7,5, após 24 horas de incubação. A enzima purificada hidrolizou eficientemente p-nitrofenil-β-D-xilopiranosideo e xilooligossacarídeos, sendo que a partir de xilobiose, xilotriose, xilotetraose e xilopentaose outros xilooligossacarídeos maiores foram sintetizados, caracterizando ação de transxilosidação. Os valores de ‘K IND M’ e ‘K IND cat’ para enzima purificada e imobilizada em PEI utilizando-se pNP-xilopiranosídeo foram de 0,654 e 0,587 mM; e 58,87 e 88,95 ‘s POT. -1’, respectivamente. Posteriormente, a β-xilosidase foi imobilizada covalentemente em Glioxil, Trietilamina-Glioxil (TEA-Glioxil), Iminodiacético-Glioxil (IDA-Glioxil), Boronato-Glioxil, e glutaraldeído como controle. A enzima imobilizou-se com uma união superior ao glutaraldeido (55%), em TEA-Glioxil (90% de imobilização) e em Boronato-Glioxil (60% de união), com uma atividade residual de 87 e 60%, respectivamente. Entretanto, a enzima teve uma baixa imobilização nos suportes Glioxil e IDA-Glioxil, contudo a atividade no derivado foi de 88%. Em vista disso, objetivou aumentar a imobilização nesses dois suportes aminando a enzima e protegendo o sítio catalítico com xilana birchwood 10%. Observou que a aminação Aumentou a imobilização em Glioxil e manteve 78% da atividade no derivado. Em relação à termoestabilidade, após 4 horas a 45°C, tanto o glutaraldeído quanto o TEA tiveram uma natividade relativa de 40-50% da inicial, enquanto o Boronato possuiu 80%. Em temperatura Maior, 50°C, o TEA manteve a sua atividade referente a 40% da inicial. Por fim,caracterizou-se o derivado TEA-Glioxil comparando-o ao glutaraldeído. Foi visto que a temperatura e pH étimos de ensaio foram de 70°-75°C e 80°C, e pH 5,0-5,5 e 5,5-6,0, respectivamente. Todos os sais analisados atuaram como inibidores da atividade da enzima unida ao glutaraldeído, enquanto que ao analisar o derivado TEA-Glioxil, verificou-se uma menor inibição da atividade enzimática pelos sais, sugerindo uma manutenção e não interferência. Por fim, analisou a hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar para a produção de açúcares fermentescíveis. O extraio bruto enzimático mostrou-se como promissor a essa ação. Com isso, conclui-se que a “beta”-xilosidase produzida pelo A. niger possuiu resultados inéditos e promissores de imobilização em distintos derivados, obtendo características vantajosas ao comparar com a enzima solúvel, bem como essa enzima mostrou-se promissora à aplicação industrial. Fazendo da estratégia de imobilização uma valiosa ferramenta para a sua aplicação em processos industriais
- Imprenta:
- Publisher place: Ribeirão Preto
- Date published: 2012
- Data da defesa: 10.12.2012
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ABNT
BENASSI, Vivian Machado. Imobilização covalente e não-covalente de β-xilosidase purificada e produção de derivados ativos estabilizados. 2012. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2012. . Acesso em: 28 mar. 2024. -
APA
Benassi, V. M. (2012). Imobilização covalente e não-covalente de β-xilosidase purificada e produção de derivados ativos estabilizados (Tese (Doutorado). Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. -
NLM
Benassi VM. Imobilização covalente e não-covalente de β-xilosidase purificada e produção de derivados ativos estabilizados. 2012 ;[citado 2024 mar. 28 ] -
Vancouver
Benassi VM. Imobilização covalente e não-covalente de β-xilosidase purificada e produção de derivados ativos estabilizados. 2012 ;[citado 2024 mar. 28 ]
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