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Glicosilação sítio específica modula a termoestabilidade de uma endo-xilanase do Grupo GH11 de Bacillus subtilis (2013)

  • Authors:
  • USP affiliated authors: MALDONADO, RAQUEL FONSECA - FMRP
  • USP Schools: FMRP
  • Sigla do Departamento: RBI
  • Subjects: BACTÉRIAS ANAERÓBICAS GRAM-POSITIVAS; MUTAGÊNESE; ENZIMAS; BACTÉRIAS (METABOLISMO)
  • Language: Português
  • Abstract: Os efeitos da glicosilação sobre a termoestabilidade da xilanase A do grupo GHl l de Bacillus subtilis (XynA) foram investigados utilizando a expressão heteróloga de proteínas em Pichia pastoris (XynApp) e Escherichia coli (‘XynA IND. Ec’). A análise da sequência de aminoácidos da XynA revelou seis potenciais sítios de glicosilação do tipo N-ligada (N8, N20, N25, N29, N141 e N181). Essas posições foram alteradas por mutagênese sítio dirigida, de forma que as asparaginas foram substituídas por glutaminas, o intuito foi alterar a quantidade e a posição dos glicanos ligados a proteína. Após a expressão heteróloga da proteína tipo selvagem em P. pastoris, três bandas proteicas foram observadas em SDSPAGE, e a análise de massa intacta após a digestão com endoglicosidase H (Endo H) revelou que as bandas correspondem a glicoformas com 2, 3 ou 4 glicanos formados por ‘GlcNA IND. C2’‘Hex IND. 8-16’. Mutações sucessivas nos múltiplos potenciais sítios de N- glicosilação geraram proteínas que apresentaram o padrão de bandas em SDS-PAGE alterado, e a análise dos peptídeos das proteínas tipo selvagem e mutantes por espectrometria de massa após digestão com Endo H e quimotripsina permitiu identificar os sítios que efetivamente estavam glicosilados. As análises de LC-MS/MS revelaram glicosilações nos resíduos N20, N25, N141 e N181 para a proteína tipo selvagem; para os mutantes simples N20Q e N25Q o sítio N29 (que não aparece glicosilado na proteína tipo selvagem) aparece glicosilado. O tempo de meia vida de catalise (tia) das enzimas mutantes não glicosiladas expressas em E. coli variou entre 2-16 minutos (‘t IND. ½’ da XynA tipo selvagem foi 9 minutos), e com exceção do mutante N20Q, todas as enzimas glicosiladas expressas em P. pastoris mostraram melhor termoestabilidade, em comparação com os homólogos não glicosilados. Impedimentos conformacionais deeventos múltiplos de glicosilação foram observados, pois a eliminação de um sítio expõe outro, e, embora não ter sido observada uma correlação entre a termoestabilidade e a quantidade de sítios de glicosilação ocupados, a posição da glicosilação foi um fator determinante. As energias potenciais de interação calculadas a partir de simulações de dinâmica molecular indicaram que a termoestabilidade foi correlacionada com as interações dos glicanos com a superfície da proteína. Mutantes com os sítios de glicosilação agrupados tendem a favorecer interações do tipo glicano-glicano que são não estabilizadores, enquanto mutantes com padrão de glicosilação em sítios mais dispersos pela superfície da proteína favorecem as interações estabilizadores do tipo proteína-glicano
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 26.04.2013

  • Exemplares físicos disponíveis nas Bibliotecas da USP
    BibliotecaCód. de barrasNúm. de chamada
    FMRP11200065729Maldonado, Raquel Fonseca
    How to cite
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    • ABNT

      MALDONADO, Raquel Fonseca; WARD, Richard John. Glicosilação sítio específica modula a termoestabilidade de uma endo-xilanase do Grupo GH11 de Bacillus subtilis. 2013.Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2013.
    • APA

      Maldonado, R. F., & Ward, R. J. (2013). Glicosilação sítio específica modula a termoestabilidade de uma endo-xilanase do Grupo GH11 de Bacillus subtilis. Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto.
    • NLM

      Maldonado RF, Ward RJ. Glicosilação sítio específica modula a termoestabilidade de uma endo-xilanase do Grupo GH11 de Bacillus subtilis. 2013 ;
    • Vancouver

      Maldonado RF, Ward RJ. Glicosilação sítio específica modula a termoestabilidade de uma endo-xilanase do Grupo GH11 de Bacillus subtilis. 2013 ;