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Estudo das bases moleculares de reações de transglicosilação em β-glicosidases GH1 de Spodoptera frugiperda e Tenebrio molitor (2011)

  • Authors:
  • USP affiliated authors: FRUTUOSO, MAIRA ARTISCHEFF - IQ
  • USP Schools: IQ
  • Sigla do Departamento: QBQ
  • Subjects: ENZIMAS; GLICOSÍDEOS (SÍNTESE); CATÁLISE
  • Language: Português
  • Abstract: Glicosídeos essenciais a vida podem ser sintetizados por métodos enzimáticos com altíssima especificidade. O mecanismo de reação de β-glicosidases GH1 por dupla-substituição envolve a formação de intermediário covalente (glicosil-enzima) que pode seguir duas rotas. Uma envolve sua hidrólise na ligação β-glicosídica entre glicone e aglicone do substrato, liberando o monossacarídeo da extremidade não-redutora; enquanto na outra rota, transglicosilação ou síntese por controle cinético, o intermediário é atacado por um aceptor glicosídico (2ª molécula de substrato), gerando um novo glicosídeo. BglB possui resíduos (W e H) que formam um "canal" por onde a água ataca o intermediário covalente no sítio ativo, sendo alvos de potenciais mutações que alteram o balanço entre as rotas e ampliando a eficiência de transglicosilação. Para caracterizar as bases moleculares da razão entre essas duas rotas catalíticas, β-glicosidases da família GH1 Spodoptera frugiperda (Sfβglu; AF052729) e Tenebrio molitor (Tmβglu; AF312017) foram produzidas como enzimas recombinantes em leveduras Pichia pastoris GS115, concentradas com 90% (p/v) de sulfato de amônio e diálise reversa com PEG 10000, e dialisadas em tampão CP 100 mM pH 6. A pureza foi confirmada por banda única com tamanho semelhante a 50 kDa (Sfβgly) e 56 kDa (Tmβgly) em SDS-PAGE. A atividade recuperada após purificação é 152% (Sfβgly) e 171% (Tmβgly) e a concentração protéica de 0,134 µg/µL (Sfβgly) e 0,217 µg/µL (Tmβgly). A razão entre as reações de hidrólise e transglicosilação (‘VIND.H’/’VIND.T’) foi analisada utilizando os substratos pNPβ-gluco (0,1 mM a 8 mM) e MUβ-gluco (0,1 mM a 40 mM), a partir da velocidade de formação dos produtos pNP ou MU e glicose, respectivamente. Tmβgly catalisa reações de transglicosilação com ambos, mas ‘VIND.H’/’VIND.T’depende da [S] variando de +∞ (‘VIND.H’>>‘VIND.T’ a 1,5 para pNPβ-gluco e +∞ a 1 para MUβ-gluco. Sfβgly, ao contrário, não transglicosila com substrato MUβ-gluco. Além disso, ‘VIND.H’/’VIND.T’ para pNPβ-gluco é 2 e independe da [S]. Já Sfβgly K201F conjuga propriedades de ambas, pois não transglicosila com MUβ-gluco, mas para pNPβ-gluco há ocorrência de transglicosilação dependente da [S], variando de +∞ (‘VIND.H’>>‘VIND.T’ a 1,25. Os parâmetros cinéticos (‘VIND.max´ e KIND.m’) foram ajustados no Enzifitter e por simulação numérica na equação do modelo cinético ping-pong para dois substratos, e mostram maior (´KIND.m2´) em Tmβgly e Sfβgly K201F do que em Sfβgly. Também foi avaliado o efeito da adição de aceptores alternativos que substituem a água em ensaios com pNPβ-gluco 4mM na presença de alcóois. Para as três enzimas a adição de metanol torna a ´VIND.glc´ menor do que de ´VIND.p´NP, indicando ocorrência de transglicosilação. Com adição de n-propanol ‘VIND.H’/’VIND.T’ diminui cerca de 7 vezes em Sfβgly e 2 vezes em Tmβgly. Os efeitos destes alcoóis sobre Sfβgly são maiores do que para Tmβgly e Sfβgly K201F, sugerindo acesso mais fácil destes ao intermediário covalente em Sfβgly, indicando diferenças entre as enzimas na configuração desta região. Portanto, notamos que ‘VIND.H’/’VIND.T’ não está ligada à afinidade pela segunda molécula de substrato, podendo ser modulada por mutação do resíduo K201 de Sfβgly, posição relacionada ao acesso da água ou aceptor alternativo ao sítio ativo
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 18.02.2011
  • Acesso online ao documento

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    BibliotecaCód. de barrasNúm. de chamada
    CQ30100025413-QT574.1925 F945e
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    • ABNT

      FRUTUOSO, Maira Artischeff; MARANA, Sandro Roberto. Estudo das bases moleculares de reações de transglicosilação em β-glicosidases GH1 de Spodoptera frugiperda e Tenebrio molitor. 2011.Universidade de São Paulo, São Paulo, 2011. Disponível em: < http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-10102014-111007/ >.
    • APA

      Frutuoso, M. A., & Marana, S. R. (2011). Estudo das bases moleculares de reações de transglicosilação em β-glicosidases GH1 de Spodoptera frugiperda e Tenebrio molitor. Universidade de São Paulo, São Paulo. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-10102014-111007/
    • NLM

      Frutuoso MA, Marana SR. Estudo das bases moleculares de reações de transglicosilação em β-glicosidases GH1 de Spodoptera frugiperda e Tenebrio molitor [Internet]. 2011 ;Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-10102014-111007/
    • Vancouver

      Frutuoso MA, Marana SR. Estudo das bases moleculares de reações de transglicosilação em β-glicosidases GH1 de Spodoptera frugiperda e Tenebrio molitor [Internet]. 2011 ;Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-10102014-111007/

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