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Preparação bioquímica para caracterização molecular e estrutural do RNA vírus LRV1-4 (2015)

  • Authors:
  • USP affiliated authors: AZEVEDO, ÉRIKA CHANG DE - IFSC
  • USP Schools: IFSC
  • Subjects: LEISHMANIA; PROTEÍNAS (ESTRUTURA); EXPRESSÃO GÊNICA
  • Language: Português
  • Abstract: O vírus de Leishmania 1-4 ( do inglês Leishmania RNA virus 1-4 ou LRV1-4) é um vírus da família Totiviridae, e que possui capsídeo icosaédrico e RNA dupla-fita que codifica duas proteínas (proteína capsidial e RNA polimerase). Dados recentes indicam o envolvimento do LRV1-4 na patogênese de Leishmania no hospedeiro humano, tornando seu estudo de fundamental importância para o entendimento dessa doença e de seu papel na relação parasito-hospedeiro. Há relatos sobre a purificação do vírus a partir do seu hospedeiro natural (Leishmania guyanensis) e a partir de sistemas de expressão heteróloga. Este trabalho tem por objetivo estabelecer os métodos de purificação para posteriores estudos estruturais por Microscopia Eletrônica de Transmissão por Contraste Negativo (NS-TEM) e por Crio-Microscopia Eletrônica (Cryo-EM). Os estudos aqui propostos irão permitir a construção de um modelo estrutural do capsídeo do LRV1-4 e sua identificação correta dentre os totivírus. Além das contribuições ao conhecimento da biologia/patogenia do LRV1-4 este estudo representa a primeira caracterização estrutural de um capsídeo viral realizada no Brasil, e assim um avanço importante para a área de virologia e biologia estrutural no pais. Foram realizadas ultracentrifugações biológicas, utilizando gradientes de sacarose, para a purificação do vírus a partir do extrato celular de L. guyanensis. As frações que apresentaram RNA viral foram analisadas por Microscopia Eletrônica de Transmissão (CampinasLNNano CNPEM). Além disso, foram realizadas tentativas de expressar a proteína do capsídeo (ORF2) em Leishmania tarentolae e Escherichia coli. Foram também realizados esforços para a obtenção de anticorpos a partir de peptídeos sintetizados após análise computacional da sequência de aminoácidos da proteína do capsídeo. As amostras obtidas a partir do hospedeiro natural do vírus se apresentaram heterogêneas quando analisadas por NS-TEM, de modo que não foi possível a realização de uma análise estrutural. Porém, a presença de partículas do tamanho esperado para o vírus em amostras em que foi detectado o RNA viral indicam que são necessários esforços para obtenção de uma amostra de maior pureza e homogênea. Além disso, não foi possível obter a proteína do capsídeo nos sistemas de expressão heteróloga. A presença de 25 resíduos de cisteína pode estar levando a proteína à degradação rápida em bactéria. Os experimentos de expressão em células de Leishmania ainda não foram conclusivos. Foi obtido um anticorpo anti-peptídeo que reconhece a proteína do capsídeo, tornando possíveis experimentos como imunolocalização e imunoprecipitação do vírus
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 26.02.2015

  • Exemplares físicos disponíveis nas Bibliotecas da USP
    BibliotecaCód. de barrasNúm. de chamada
    IFSC82002387Te2387
    How to cite
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    • ABNT

      AZEVEDO, Érika Chang de; THIEMANN, Otavio Henrique. Preparação bioquímica para caracterização molecular e estrutural do RNA vírus LRV1-4. 2015.Universidade de São Paulo, São Carlos, 2015.
    • APA

      Azevedo, É. C. de, & Thiemann, O. H. (2015). Preparação bioquímica para caracterização molecular e estrutural do RNA vírus LRV1-4. Universidade de São Paulo, São Carlos.
    • NLM

      Azevedo ÉC de, Thiemann OH. Preparação bioquímica para caracterização molecular e estrutural do RNA vírus LRV1-4. 2015 ;
    • Vancouver

      Azevedo ÉC de, Thiemann OH. Preparação bioquímica para caracterização molecular e estrutural do RNA vírus LRV1-4. 2015 ;

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