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Caracterização do mutante exo-1 de Neurospora crassa, cultivado por fermentação no estado sólido: produção e caracterização de uma β-glucosidase e uma xilanase majoritárias (2014)

  • Authors:
  • USP affiliated authors: GENTIL, SANDRA LAZARI - FFCLRP
  • USP Schools: FFCLRP
  • Subjects: FUNGOS; ENZIMAS; BIOQUÍMICA
  • Language: Português
  • Abstract: A utilização industrial de enzimas é crescente, gerando grande interesse na identificação de novas enzimas com propriedades mais adequadas a cada processo, bem como de microrganismos bons produtores destas enzimas em meios de baixo custo. A linhagem exo-1 é um dos mutantes morfológicos de Neurospora crassa Apresenta uma alteração na permeabilidade da parede celular que, em cultivo submerso, resulta na hiperprodução/hipersecreção de enzimas. O objetivo deste trabalho foi a caracterização do mutante exo-1 crescido por fermentação em estado sólido, com ênfase na produção de ß-glucosidases e xilanases, enzimas ainda não exploradas neste organismo e com potencial de aplicação biotecnológica. A maior produção de ß-glucosidases por exo-1 (150,3 U/g) foi obtida após 10 dias de cultivo a 25°C em farelo de trigo suplementado com ‘NH IND. 4’‘NO IND. 3’ 0,5%, com umidade inicial 2,0 mL de ‘H IND. 2’O/g de farelo. Xilanases foram produzidas simultaneamente, em bons níveis (468,0 U/g). Uma ß-glucosidase (NcBG1) e uma xilanase (NcX1) majoritárias foram purificadas. A análise de NcBG1 e NcX1 por espectrometria de massas permitiu a sua identificação no genoma de N. crassa respectivamente como uma , ß-glucosidase da família GH3-4 (BGL2, gene bgl2) e uma endoxilanase da família GH-10 (GH10-1, gene NCU05924). As massas moleculares de NcBG1 e NcX1 estimadas por SDS-PAGE foram respectivamente 93 e 36 kDa, enquanto suas massas moleculares na forma nativa, determinadas por filtração em gel, foram de 95,8 e 33,7 kDa, respectivamente, sugerindo que são monoméricas. Eletroforese bidimensional de NcBG1 revelou 4 isoformas com valores de pI de 6,59; 6,75; 6,93 e 7,10, sugerindo diferenças em modificações pós-traducionais; uma única isoforma de NcX1 foi evidenciada, com pI de 7,85. NcBG1 mostrou pH e temperatura étimos de 5,0 e 60°C, respectivamente, com atividade de 40-60% damáxima entre 30 e 40°C. A enzima mostrou boa estabilidade em pH 3-10 por 24 h e também a 40°C por 60 min, com atividades residuais de 70 e 60% após 120 min a 45 e 50°C, respectivamente. Os parâmetros cinéticos para a hidrólise de pNP-glc por NcBG1 foram ‘V IND. max’= 97,0 ± 4,6 U/‘mg POT. -1’ e ‘K INd. 0,5’= 0,063 ± 0,003 mmol ‘L POT. -1’, enquanto para a celobiose obteve-se 55,0 ± 2,8 U/‘mg POT. -1’ e 0,88 ± 0,04 mmol /‘L POT. -1’, demonstrando que o pNPglc (‘k IND. cat’/‘K IND. 0,5’= 2457,1 L.‘mmol POT. -1’‘s POT. -1’) é melhor substrato para a enzima, comparado à celobiose (‘k IND. cat’/‘K IND. 0,5’= 99,8 L.‘mmol POT. -1’‘s POT. -1’). A atividade de NcBG1 sobre pNP-glc foi estimulada 82 e 47% por etanol em concentração 10 e 20% (v/v), respectivamente, porém inibida competitivamente por glicose (‘K IND. I’ 1,85 ± 0,09 mmol ‘L POT. -1’). Xilose estimulou a atividade até 1,6 vezes, em concentrações de 250-400 mmol ‘L POT. -1’; atividades acima do controle foram estimadas até a concentração de 750 mmol ‘L POT. -1’. A constante de afinidade aparente de NcBG1 para a xilose foi de 36,1 ± 1,8 mmol. ‘L POT. -1’, com ‘V IND. max’ de 172,1 ± 8,6 U/‘mg POT. -1’. Em presença de xilose 400 mmol ‘L POT. -1’, o valor de ‘K IND. 0,5’ para o pNPglc aumentou 2,7 vezes, sugerindo que além de estimular a atividade a xilose compete com o substrato pela ligação ao sitio ativo. Temperatura e pH ótimos para a hidrólise de xilana por NcX1 foram 60°C e 6,0, respectivamente. A enzima mostrou boa estabilidade em pH 6-10 e manteve 90% da atividade a 45°C por até 4h, com ‘t IND. ½’ de 71 min a 50°C. Xilana foi hidrolisada por NcX1 com ‘V IND. max’= 457,3 ± 32,0 U‘mg POT. -1’ e ‘K IND. 0,5’=0,89 ± 0,06 mg/mL e a análise dos produtos de hidrólise foi compatível com a ação de umaendoxilanase. Os resultados obtidos mostraram que exo-1 é um bom produtor de ß-glucosidases e xilanases, comparado a outras linhagens de N. crassa e a outros fungos mesófilos, quando cultivados em meios constituídos majoritariamente de subprodutos da agroindústria. As propriedades de NcBG1 sugeriram bom potencial de aplicação em processos de liberação de aromas na indústria de vinhos, enquanto NcX1 mostrou características mais adequadas para a sacarificação de biomassa lignocelulósica.
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 01.12.2014

  • Exemplares físicos disponíveis nas Bibliotecas da USP
    BibliotecaCód. de barrasNúm. de chamada
    FCLRP20800048987Gentil, Sandra Lazari
    How to cite
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    • ABNT

      GENTIL, Sandra Lazari; FURRIEL, Rosa dos Prazeres Melo. Caracterização do mutante exo-1 de Neurospora crassa, cultivado por fermentação no estado sólido: produção e caracterização de uma β-glucosidase e uma xilanase majoritárias. 2014.Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2014.
    • APA

      Gentil, S. L., & Furriel, R. dos P. M. (2014). Caracterização do mutante exo-1 de Neurospora crassa, cultivado por fermentação no estado sólido: produção e caracterização de uma β-glucosidase e uma xilanase majoritárias. Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto.
    • NLM

      Gentil SL, Furriel R dos PM. Caracterização do mutante exo-1 de Neurospora crassa, cultivado por fermentação no estado sólido: produção e caracterização de uma β-glucosidase e uma xilanase majoritárias. 2014 ;
    • Vancouver

      Gentil SL, Furriel R dos PM. Caracterização do mutante exo-1 de Neurospora crassa, cultivado por fermentação no estado sólido: produção e caracterização de uma β-glucosidase e uma xilanase majoritárias. 2014 ;