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Silenciamento gênico pós-transicional por interferência por RNA (RNAi) com terapia antiviral para a raiva (2015)

  • Authors:
  • USP affiliated authors: ONO, EKATERINA ALEXANDROVNA DURYMANOVA - FMVZ
  • USP Schools: FMVZ
  • Subjects: ANTIVIRAIS; RAIVA; VÍRUS; ZOONOSES
  • Keywords: Rabies; RNA interference; RNA interferência; Tratamento; Treatment
  • Language: Português
  • Abstract: A raiva é uma zoonose que afeta todos os mamíferos e causa cerca de 55.000 mortes humanas por ano, causada pelo vírus da raiva. O vírus da raiva pertence à Ordem Mononegavirales, Família Rhabdoviridae e o Gênero Lyssavirus. Ultimamente, o Protocolo de Milwaukee é a base do tratamento humano, com indução do paciente ao coma e uso de massiva terapia antiviral. O protocolo, embora tenha sido utilizado duas vezes com sucesso, inclusive em um caso brasileiro, ainda requer aperfeiçoamentos. Neste sentido, a interferência por RNA (RNAi) é uma nova abordagem para terapia de doenças virais. O objetivo deste trabalho foi avaliar a inibição da replicação do vírus da raiva in vitro e in vivo utilizando RNAi. Para este fim, foram utilizados três siRNAs (siRNA 360, siRNA 652, siRNA 649) com a fita antisenso complementar ao mRNA da fosfoproteína (P) e três siRNAs (Le 1, Le 2, Le 3) contra o RNA líder do vírus da raiva. Para o ensaio in vitro foram utilizadas as amostras PV e 4005 (AgV3) do vírus da raiva e as células de BHK-21 (Baby hamster kidney). As monocamadas celulares foram infectadas com as amostras PV ou 4005 e depois de 2 horas de incubação transfectadas com cada um dos siRNAs em combinação com Lipofectamine 2000TM. Depois de 24 e 48 horas as placas teste e controle foram submetidas à imunofluorescência direta (IFD) com conjugado globulina de coelho anti-ribonucleocapsídeo do vírus da raiva/isotiocianato de fluoresceína (Instituto Pasteur de São Paulo). Os resultados revelaram queos siRNAs contra o RNA líder do vírus não foram capazes de inibir a replicação do vírus. A utilização dos siRNAs contra mRNA P resultaram em títulos de 3,625logTCID50/ml, 3,875logTCID50/ml e 4,125logTCID50/ml para os siRNAs 360, 649 e 652, respectivamente, enquanto que, para a placa controle, o título foi 4,0logTCID50/ml nas placas infectadas com PV e período de incubação de 24h. Nas placas infectadas com a amostra 4005 e tratadas com siRNAs, a maior queda de título viral foi na placa tratada com siRNA 360, de 1,0 log, comparando-se com a placa controle de incubação de 24 para a amostra 4005. Nas placas tratadas com siRNA 649 e siRNA 652, também houve a diminuição de título viral, mas em uma escala menor (0,25log e 0,125log, respectivamente) comparando-se com o controle. Nas placas infectadas com PV e incubadas durante 48h, os títulos apresentados foram de 5,625logTCID50/ml, 4,625logTCID50/ml e 4,75logTCID50%/ml para os siRNAs 360, 649 e 652, respectivamente, enquanto que na placa controle o título foi 6,0logTCID50C%/ml. A placa com período de incubação de 48h com a amostra 4005 e tratada com siRNA 360 apresentou a maior queda de título viral entre os três siRNAs, o que resultou em 1,125log de diferença. Nas monocamadas onde foram administrados siRNA 649 e siRNA 652, observou-se também uma pequena queda de título viral igual a 0,875log e 0,295log, respectivamente, comparando-se com a placa não tratada. Para o ensaio in vivo, foram usados camundongos albino suíços de 21 diascom peso entre 11 e 14g, infectados com a cepa PV e AgV3 em 10DL50% via intracerebral. Duas horas depois da infecção, foi inoculada por via intracerebral uma solução do siRNA 360 com Lipofectamine 2000TM. Os animais com paralisia foram eutanasiados e aqueles sobreviventes foram observados até completar 30 dias de observação quando foram, então, eutanasiados. O sistema nervoso central de todos os animas foi recolhido e submetido a IFD. A utilização do siRNA 360 em camundongos resultou em 30% de animais sobreviventes frente amostra 4005, enquanto que a mortalidade nos animais não tratados foi de 90%. Nos animais inoculados com a amostra PV e tratados com este siRNA, a sobrevivência foi de 40%, enquanto que no grupo controle a mortalidade foi de 100%. O resultado do ensaio in vitro demonstra que os siRNAs utilizados são capazes de inibir a replicação do vírus da raiva, com eficiência mais pronunciada para o siRNA 360. In vivo, este siRNA foi capaz de induzir a proteção parcial dos animais inoculados com as duas variantes virais. Estes resultados, ainda que indiquem a necessidade de mais estudos, permitem concluir que a RNAi é uma tecnologia promissora como antiviral contra a raiva
  • Imprenta:
  • Data da defesa: 20.03.2015
  • Acesso online ao documento

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    • ABNT

      ONO, Ekaterina Alexandrovna Durymanova; BRANDÃO, Paulo Eduardo. Silenciamento gênico pós-transicional por interferência por RNA (RNAi) com terapia antiviral para a raiva. 2015.Universidade de São Paulo, São Paulo, 2015. Disponível em: < http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/10/10134/tde-18082015-153913/ >.
    • APA

      Ono, E. A. D., & Brandão, P. E. (2015). Silenciamento gênico pós-transicional por interferência por RNA (RNAi) com terapia antiviral para a raiva. Universidade de São Paulo, São Paulo. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/10/10134/tde-18082015-153913/
    • NLM

      Ono EAD, Brandão PE. Silenciamento gênico pós-transicional por interferência por RNA (RNAi) com terapia antiviral para a raiva [Internet]. 2015 ;Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/10/10134/tde-18082015-153913/
    • Vancouver

      Ono EAD, Brandão PE. Silenciamento gênico pós-transicional por interferência por RNA (RNAi) com terapia antiviral para a raiva [Internet]. 2015 ;Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/10/10134/tde-18082015-153913/

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