Identificação de domínios em β-glicosidases GH1 através da análise de sua estabilidade (2016)
- Authors:
- Autor USP: ALMEIDA, VITOR MEDEIROS - IQ
- Unidade: IQ
- Sigla do Departamento: QBQ
- Subjects: ENZIMOLOGIA; PROTEÍNAS; ESTABILIDADE
- Language: Português
- Abstract: Introdução e objetivos: β-glicosidases da família GH1 das glicosil-hidrolases possuem um dobramento do tipo barril ‘(β/α) IND.8’. Propõe-se que proteínas com este dobramento, que usualmente classificam-se como tendo um único domínio, na verdade são compostas por dois domínios, cada um deles correspondendo a um "meio barril" ‘(β/α) IND.4’. Assim, as proteínas com dobramento barril ‘(β/α) IND.8’ seriam provenientes de uma duplicação e fusão gênica de um ancestral "meio barril" ‘(β/α) IND.4’. O objetivo geral deste projeto é investigar a existência de dois domínios ‘(β/α) IND.4’, as metades N- e C-terminal, na estrutura ‘(β/α) IND.8’ barril da β-glicosidase A de Thermotoga maritima (bglTm) e β-glicosidase B de Paenibacillus polymyxa (bglB) por meio de análise da desnaturação térmica e química dessas enzimas. Resultados: Para atingir esse objetivo foram introduzidas mutações que rompem contatos não covalentes entre os supostos domínios destas β-glicosidases. Os segmentos de DNA que codificam as enzimas selvagem e mutantes foram clonados em plasmídeo de expressão pLATE51 e as enzimas recombinantes expressas em Escherichia coli BL21(DE3). Foram purificadas com sucesso as enzimas selvagens e duas mutantes de bglTm, denominadas T1 e T2, que possuem 2 e 4 mutações respectivamente em resíduos na interface inter-metades. Para confirmar o enovelamento destas proteínas recombinantes foi empregada a análise de estruturas secundárias por dicroísmo circular, também o espectro de fluorescência intrínseca de triptofano e sua supressão por acrilamida e finalmente foram determinados parâmetros cinéticos. Observou-se que não houve mudanças significativas na exposição dos triptofanos das proteínas recombinantes, sugerindo que se encontram enoveladas, o que está de acordo com a observação de que as proteínas recombinantes mantêm sua atividadecatalítica. Já pela análise de dicroísmo circular concluiu-se que a mutante T1 possui dobramento semelhante à selvagem bglTm e que T2 apresenta diferenças significativas, sendo as porcentagens de α-hélice de 21%, 22% e 10% para bglTm, T1 e T2, respectivamente. Em seguida demonstrou-se que T1 mantém a termo estabilidade semelhante à selvagem, enquanto que T2 tem termo estabilidade reduzida, apresentando ‘k IND.obs’ de ‘0,3 min POT.-1’ em 80°C e de 0,06 ‘min POT.-1’ em 75 °C.. O cálculo de ‘T IND.m’ através de Differential Scanning Fluorimetry foi feito para bglB e T2 (42 e 81.7 °C respectivamente), enquanto que bglTm e T1 mantiveram-se estáveis na faixa de temperatura analisada (até 95°C). Na análise do efeito da temperatura sobre a estrutura das mutantes T1 e T2 não se observou nenhuma evidência da presença dos dois supostos domínios ‘(β/α) IND.4’. A análise da desnaturação por cloreto de guanidina mostrou que o ‘c IND.50’ diminuiu para T2 (2,4 M), mas não mostrou alteração para T1 (4,5 M) em comparação à bglTm (4,3 M). Coerentemente, a estabilidade da enzima selvagem e de T1 na ausência de desnaturante é a mesma (‘ΔG IND.H IND.2 O’ = 5,2 kcal/mol), mas se reduziu para a T2 (‘ΔG IND.H IND.2 O’ = 3,5 kcal/mol). Os cálculos do parâmetro m mostraram uma cooperatividade semelhante na desnaturação de bglTm, T1 e T2, não evidenciando independência entre os dois supostos domínios ‘(β/α) IND.4’. Em conclusão, a análise estabilidade da β-glicosidase bglTm frente à temperatura e ao cloreto de guanidina não revelaram a presença dos domínios ‘(β/α) IND.4’ que correspondem às metades N- e C-terminal desta β-glicosidase
- Imprenta:
- Data da defesa: 14.06.2016
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ABNT
ALMEIDA, Vitor Medeiros. Identificação de domínios em β-glicosidases GH1 através da análise de sua estabilidade. 2016. Dissertação (Mestrado) – Universidade de São Paulo, São Paulo, 2016. Disponível em: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-22082016-082333/. Acesso em: 24 abr. 2024. -
APA
Almeida, V. M. (2016). Identificação de domínios em β-glicosidases GH1 através da análise de sua estabilidade (Dissertação (Mestrado). Universidade de São Paulo, São Paulo. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-22082016-082333/ -
NLM
Almeida VM. Identificação de domínios em β-glicosidases GH1 através da análise de sua estabilidade [Internet]. 2016 ;[citado 2024 abr. 24 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-22082016-082333/ -
Vancouver
Almeida VM. Identificação de domínios em β-glicosidases GH1 através da análise de sua estabilidade [Internet]. 2016 ;[citado 2024 abr. 24 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-22082016-082333/ - Homodimerization of a glycoside hydrolase family GH1 β-glucosidase suggests distinct activity of enzyme different states
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