Relação estrutura-função de uma β-glucosidase estimulada por glicose e xilose do fungo termófilo Humicola insolens: estudos de evolução dirigida (2017)
- Authors:
- Autor USP: MELEIRO, LUANA PARRAS - FFCLRP
- Unidade: FFCLRP
- Sigla do Departamento: 593
- Subjects: QUÍMICA; GLICOSÍDEOS; FUNGOS TERMÓFILOS
- Keywords: Estimulação por glicose e xilose; Glicosilação; Glycosylation; Humicola insolens; Stimulation by glucose and xylose; Termoestabilidade; Thermostability; Transglicosilação; Transglycosylation
- Language: Português
- Abstract: Um dos pré-requisitos para a produção economicamente viável de etanol a partir da biomassa lignocelulósica é o desenvolvimento de processos eficientes e baratos de hidrólise enzimática de celulose e hemicelulose. As enzimas respondem por altas percentagens dos custos de hidrólise, pois é necessário utilizar altas cargas enzimáticas para obter rendimentos aceitáveis devido à inibição das enzimas lignocelulolíticas pelos produtos, que se intensifica com o uso de altas concentrações iniciais de biomassa. Uma das estratégias para melhorar a eficiência e diminuir os custos da hidrólise é a identificação de enzimas mais eficientes, com grande atenção para aquelas tolerantes e/ou estimuladas pelos produtos de reação. Nesse contexto, a engenharia de proteínas é uma poderosa ferramenta para o melhoramento e o entendimento da relação estrutura-função destas enzimas. O presente trabalho visou avaliar o efeito da glicosilação sobre as características bioquímicas de uma - glucosidase estimulada por glicose e xilose de Humicola insolens, comparando a enzima nativa e as enzimas recombinantes, expressas em Escherichia coli (Bglhi) e Pichia pastoris (BglhiPp), além de estudar a relação estrutura-função por meio de técnicas de evolução dirigida objetivando o entendimento dos mecanismos envolvidos na estimulação da enzima pelos monossacarídeos. Com relação à glicosilação, a expressão e caracterização da BglhiPp permitiu avaliar que as principais características influenciadas por diferentesconteúdos de carboidratos na enzima foram a temperatura ótima e a termoestabilidade. Já o estudo de evolução dirigida culminou na geração de 4 mutantes com padrão de estimulação por glicose e xilose diferentes da Bglhi (utilizada como controle). Todos os mutantes contêm uma das duas substituições (D237V e N235S) agrupadas ao redor dos subsítios de ligação da aglicona (+1 e +2). Os dados cinéticos e de transglicosilação permitiram sugerir que o mecanismo de estimulação destas enzimas envolve interações alostéricas, modulação das rotas de hidrólise e transglicosilação e competição entre substrato e monossacarídeos pela ligação aos subsítios do sítio ativo. A mutação D237V (presente nos mutantes 4-12D e 5-7H) favoreceu a rota de hidrólise em detrimento à de transglicosilação e a atividade pNP-glucosidásica, mas não a celobiásica, foi estimulada por xilose. A substituição N235S (presente nos mutantes 1-6D e 5-7C) aboliu a preferência por hidrólise ou transglicosilação e a atividade celobiásica, mas não a pNP-glucosidásica, foi fortemente inibida por xilose. Além disso, ambas as mutações diminuíram a tolerância das enzimas pelos monossacarídeos. Estes resultados mostraram que a modulação fina da atividade da Bglhi e das enzimas dos mutantes por glicose e/ou xilose é regulada pelas afinidades relativas dos subsítios da glicona e da aglicona pelos substratos e pelos monossacarídeos livres. As mudanças na topologia e nas propriedades físico-químicas dos subsítios +1 e +2 da aglicona foi proposta por racionalizar os dados cinéticos e de transglicosilação
- Imprenta:
- Publisher place: Ribeirão Preto
- Date published: 2017
- Data da defesa: 14.02.2017
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ABNT
MELEIRO, Luana Parras. Relação estrutura-função de uma β-glucosidase estimulada por glicose e xilose do fungo termófilo Humicola insolens: estudos de evolução dirigida. 2017. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2017. Disponível em: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/59/59138/tde-14032017-110904/. Acesso em: 19 abr. 2024. -
APA
Meleiro, L. P. (2017). Relação estrutura-função de uma β-glucosidase estimulada por glicose e xilose do fungo termófilo Humicola insolens: estudos de evolução dirigida (Tese (Doutorado). Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/59/59138/tde-14032017-110904/ -
NLM
Meleiro LP. Relação estrutura-função de uma β-glucosidase estimulada por glicose e xilose do fungo termófilo Humicola insolens: estudos de evolução dirigida [Internet]. 2017 ;[citado 2024 abr. 19 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/59/59138/tde-14032017-110904/ -
Vancouver
Meleiro LP. Relação estrutura-função de uma β-glucosidase estimulada por glicose e xilose do fungo termófilo Humicola insolens: estudos de evolução dirigida [Internet]. 2017 ;[citado 2024 abr. 19 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/59/59138/tde-14032017-110904/ - Immobilization of a β-glucosidase and an endoglucanase in ferromagnetic nanoparticles: a study of synergistic effects
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